甘藍SNP標記開發及主要品種的DNA指紋圖譜構建

李志遠，于海龍，方智遠，楊麗梅，劉玉梅，莊木，呂紅豪，張揚勇

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

0 引言

【研究意義】結球甘藍（Brassica oleraceaL. var.capitata）簡稱甘藍，在中國各地廣泛栽培。截止至2015年，中國審（鑒、認）定或登記的甘藍品種共計 247個[1-5]，其中大部分為一代雜種。近年來，市場上的甘藍品種不斷增多，種植面積不斷增大。但是，在種子市場上同名異物及同物異名的情況時有發生，甚至一些不合格種子混入市場，造成巨大的經濟損失。因此，對品種進行快速準確鑒定，對于假種辨別和產權糾紛具有重要作用。【前人研究進展】早期的品種鑒定手段主要依賴于形態學鑒定，這種方法耗時較長且易受環境影響。隨著分子生物學的發展，分子標記技術的出現為品種鑒定提供了新的手段。分子標記技術具有周期短、不受環境條件影響、可進行高通量測試分析等優點，已經在品種鑒定、種子純度鑒定等方面得到廣泛應用[6-7]。隨著生物技術的進步，陸續有基于RFLP、AFLP、SSR、SNP等分子標記用于DNA指紋圖譜的構建。其中，SNP分子標記是國際植物新品種權保護聯盟（UPOV）BMT分子測試指南中構建DNA指紋數據庫的推薦標記之一[8]。相對于傳統標記，利用SNP標記構建的指紋圖譜具有數量多、分布廣泛、穩定性高、易于快速且高通量分型的特點[9-10]。分子標記技術在甘藍品種指紋圖譜構建中得到了廣泛的應用，薄天岳等[11]通過SRAP、RAPD 2種分子標記方法，構建了甘藍品種‘爭春’、 ‘寒光2號’及其各自親本的DNA指紋圖譜，并將其用于種子純度鑒定。宋順華等[12]利用AFLP標記對來自全國的44份甘藍品種進行分析，并構建了其指紋圖譜。陳琛等[13]利用5對SSR標記構建了6個秋甘藍品種及其親本共18份材料的指紋圖譜。王慶彪等[5]利用20對SSR標記構建50份中國甘藍代表品種DNA指紋數據庫并闡述了甘藍SSR-DNA指紋鑒定的應用和技術流程。【本研究切入點】目前，甘藍品種鑒定中常用的指紋圖譜是基于AFLP、SSR等分子標記。但是，傳統AFLP、SSR指紋圖譜存在標記數量有限、檢測位點少，位點的突變率高、對變異反應比較敏感等缺點。SNP標記作為第三代分子標記，具有數量多、分布廣泛、二態性、易于快速且高通量的進行基因分型等優點。SNP標記已經在玉米[14]、油菜[15]、香菇[16]等作物指紋圖譜構建中得到應用，但在甘藍類蔬菜中尚未有基于 SNP標記的指紋圖譜。【擬解決的關鍵問題】本研究基于甘藍高代自交系的重測序數據開發SNP標記，利用KASP技術對主要甘藍品種進行基因分型[17]，根據分型結果篩選篩選在染色體上均勻分布、多態性信息較高的SNP位點作為核心標記，并利用核心SNP標記構建甘藍品種指紋圖譜，為甘藍品種真實性、特異性鑒定提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2016年12月至2017年5月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所甘藍遺傳育種實驗室進行。

指紋圖譜構建：從國內主要育種單位搜集（鑒定、登記）市場上推廣的主要代表品種59個（電子附表1）。

核心SNP標記驗證：在上述59個主要甘藍品種中挑選15個已推廣的品種，及5個未推廣的新組合。每個品種或組合取3粒種子，將種子混合構成人工虛擬混合群體。

1.2 DNA提取

將59個主要代表品種的種子放于培養皿中，采用紙上發芽，放置于25℃恒溫培養箱中，催芽5—6 d。取子葉和下胚軸，每份樣品中取若干個體，共計0.5 g，采用改良 CTAB法[18]提取 DNA，使用冷凍干燥機將樣品DNA抽干后置于-80℃保存。

將人工虛擬混合群體種子混合催芽，然后按單個幼苗提取DNA。

1.3 KASP標記開發及檢測

對50個甘藍高代自交系進行重測序，所測的自交系涵蓋了不同茬口（春、秋、越冬）、不同熟性（早、中、晚）及不同球型（扁、圓、尖）的材料，具有很好的代表性。利用重測序數據與參考基因組（02-12）[19]進行比對，開發SNP位點。對獲得的SNP位點按以下條件進行篩選：（1）位點的未測通材料數＜20；（2）多態性在40%—60%；（3）在染色體中均勻分布；（4）位點前后各50 bp不存在其他變異。對于篩選獲得的SNP位點，截取其前后各50 bp序列，交由LGC公司開發設計KASP引物。

PCR反應體系（10.14 μL）為KASP Master mix 5 μL、KASP Primer mix 0.14 μL和模板DNA（20 ng·μL-1）5 μL。PCR反應條件為第一輪94℃ 15 min；94℃20 s，61—55℃ 60 s，10個Touch Down循環（每個循環降低0.6℃）；第二輪94℃ 20 s，55℃ 60 s，26個循環。使用熒光微孔板檢測儀檢測 PCR產物，用LGC公司開發的SNPviewer軟件讀取檢測數據。所用KASP Master mix 購自英國 LGC公司，貨號為KBS-1016-012。

1.4 數據處理

根據分型結果計算出各個標記的等位基因頻率，然后利用軟件PIC_Calc 0.6計算各標記的多態性信息含量（polymorphism information content，PIC），計算公式為PIC = 1-∑fi2，其中fi為i位點基因頻率。依據SNP標記具有的二態性特點，將分型數據轉化為二元編碼數據，將野生型（與參考基因組一致）表示為（1，0），突變體表示為（0，1），將雜合基因型表示為（1，1），缺失堿基位點記為（999，999），對每份材料進行基因型統計，利用NTSYSpc2.1軟件進行相似系數計算及基于UPGMA算法的聚類分析[15]。

1.5 核心SNP位點的挑選及其在品種鑒定中的應用

根據基因分型結果，篩選出多態性信息含量＞0.35、無基因型數據缺失、在9條染色體上均勻分布的SNP位點作為構建甘藍品種指紋圖譜的核心位點。

利用核心SNP標記位點，對人工構建的虛擬混合群體進行SNP標記分析，并與已有SNP-DNA指紋圖譜進行比對，判定虛擬混合群體的60個樣品的分型結果是否與指紋圖譜數據庫中相應品種對應。

2 結果

2.1 甘藍SNP標記的開發

對50個甘藍高代自交系進行重測序，平均測序深度為5×。將重測序數據與參考基因組02-12進行比對，共獲得SNP位點2.54×106個。篩選位點多態性介于40%—60%、未測通材料數＜20的SNP位點，共獲得2.59×104個。進一步篩選在9條染色體上均勻分布、位點前后各50 bp不存在其他變異位點的SNP位點，最終獲得500個SNP位點用于下一步試驗，平均每條染色體上55.6個。500個SNP位點中有442個成功轉化為KASP標記，轉化成功率為88.4%。

利用KASP平臺對59個甘藍品種進行基因型檢測，442個KASP標記全部成功分型。在442個標記中，有25個標記的未分型材料數＞5，為保證結果準確性，在后續分析中將這25個標記去除。在59個甘藍品種中，全部標記的雜合位點比例大于30%的品種有57個，占所有品種的96.6%（圖1）。其中，品種‘豫生早熟牛心’的雜合位點比例最高，為 67.8%；‘秦甘78’雜合位點比例最低，為18.8%。所有SNP標記在全部品種中多態性信息含量（PIC）處于 0.12—0.38，PIC值大于0.35的位點占所有位點的63.5%，其中PIC值為0.37的位點最多，有157個（圖2）。

2.2 核心SNP位點的挑選及DNA指紋圖譜的構建

綜合考慮基因分型結果，篩選PIC值大于0.35、無基因型數據缺失、在9條染色體上均勻分布的SNP位點作為構建甘藍品種指紋圖譜的核心位點，最終獲得50個SNP位點用以構建主要品種的指紋圖譜（表1）。50個核心SNP位點中，位點Bol2-56的PIC值最高，為0.38；位點Bol8-11的PIC值最低，為0.35；平均PIC值為0.36，表現為中度多態性。

將59個主要品種的核心位點分型結果轉化為二元編碼數據，得到主要甘藍品種的指紋圖譜（表2）。參考甘藍SSR-DNA指紋鑒定技術流程，品種間差異位點數≥2則可判定為不同品種。利用50個核心SNP位點構建的指紋圖譜，各品種間差異位點數均≥2，因此，利用該DNA指紋圖譜可對甘藍品種進行有效區分。

圖1 417個SNP標記的多態性信息含量分布情況Fig. 1 Distribution of polymorphism information content in 417 SNP markers

圖2 基于417個SNP標記的59個主要甘藍品種的雜合基因型比例Fig. 2 Heterozygous genotype ratio of 59 main varieties based on 417 SNPs

2.3 主要甘藍品種的聚類分析

根據50個核心位點的分型結果，利用NTSYS軟件對59個供試品種進行聚類分析（圖3）。結果表明，育成品種兩兩間的遺傳相似系數為0.43—0.98。其中，‘秦甘 78號’與‘爭春’的遺傳相似系數最小，為0.43，二者之間存在41個差異標記，這說明二者親緣關系最遠。而‘中甘21’與‘中甘628’的遺傳相似系數最大，為0.98，二者之間的差異標記僅有2個，說明它們的遺傳背景很相似。分析‘中甘21’與‘中甘 628’的系譜發現，二者的父本完全相同，母本都是圓球春甘藍材料。

在遺傳相似系數0.60處，可將所有供試品種分為兩大類群。第一大類群共包含33個品種，在遺傳相似系數0.64處可劃分為3個亞類，‘中甘8號’、‘晚豐’等11個品種為第1亞類；‘春豐’、‘博春’為第2亞類；第3亞類包含‘春甘2號’、‘爭春’等在內的20個品種。第二大類主要為圓球或近圓球類型甘藍，共25個品種，在遺傳相似系數0.61處可劃分為2個亞類，將其命名為第4亞類與第5亞類。其中，第4亞類包含21個品種；第5亞類包含5個品種。聚類分析的結果與供試品種的來源有很強的相關性，例如：山西省農業科學院育成的惠豐系列甘藍、河南省

農業科學院育成的豫甘系列甘藍、江蘇鎮江農業科學研究所育成的瑞甘系列甘藍，上述單位培育的一系列甘藍品種之間呈現較近的親緣關系，聚類分析時聚在一起。結果表明，SNP聚類結果與供試品種的表型性狀和地理來源相一致，能準確的反映供試品種的親緣關系。

表1 用于構建指紋圖譜的50對核心引物Table 1 The information of 50 core primers for fingerprinting

續表1 Continued table 1

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2.4 核心標記在品種鑒定中應用

通過人工構建的虛擬混合群體對DNA指紋圖譜

的核心位點進行驗證，利用50個核心SNP標記對虛擬混合群體進行基因分型檢測，并與已構建的 DNA指紋圖譜進行比對。基因分型結果顯示：虛擬混合群體中來源于同一品種的3個樣品其分型結果完全相同，這說明核心SNP標記具有較好的重復性。虛擬混合群體中有45個樣品（15個品種）的分型結果與DNA指紋圖譜中相應品種完全對應。剩余的15個樣品（5個新組合），與指紋庫中材料均表現出較大差異（差異位點數＞2），在指紋庫中無對應品種。結果表明，利用50個核心SNP標記可實現對甘藍品種真實性和特異性的有效鑒定。

表2 中國59 份主要甘藍品種的SNP-DNA 指紋圖譜數據庫Table 2 SNP-DNA Finger-printing database of 59 main cabbage varieties from China

續表2 Continued table 2

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圖3 59個主要甘藍品種的SNP聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram based on SNP for 59 main cabbage varieties

3 討論

3.1 主要甘藍品種的代表性

目前，中國甘藍種植面積約90萬hm2[20-21]，在蔬菜周年供應中占據重要地位。中國甘藍品種選育開始于20世紀50年代、70年代以后得到快速發展。目前市場上審定推廣的甘藍品種大都為一代雜種，一代雜種的種植面積占總種植面積的90%以上[21]。

本試驗中所選用的 59個甘藍品種全為一代雜種。在59個甘藍品種中，年推廣面積曾達到1×104hm2以上[23]且目前還有大面積種植的品種就有十幾個，如‘京豐一號’、‘8398’、‘中甘21’、‘晚豐’、‘慶豐’、‘中甘15’、‘中甘11’、‘春豐’、‘爭春’、‘西園四號’等，這些品種占到國內甘藍種植面積的 60%—70%[24]。本試驗中所選的59個主要甘藍品種涵蓋了不同球型（圓球、扁球、牛心型）、不同栽培季節（春甘藍、秋甘藍、越冬甘藍）及不同熟性（早、中、晚熟），這些品種具有廣泛的代表性。

3.2 基于SNP位點構建DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜技術（DNA-Fingerprinting）是由英國科學家Jeffreys于1986年開發，具有快速、準確等優點，是鑒別品種、品系的有力工具，已廣泛應用于很多作物的品種資源多樣性和純度鑒定研究，陸續將RFLP、AFLP、SSR、SNP等標記技術用于構建DNA指紋圖譜。其中，SSR指紋技術由于其重復性好、簡單易于操作、且大多數為共顯性標記，常用于品種鑒定分析，已在水稻[25]、玉米[26]、柑橘[27]、甜瓜[28]等多種作物中得到應用。在甘藍中，基于SSR標記已建立了50個代表品種的指紋圖譜，并制定了 SSR分子標記法進行甘藍品種鑒定的技術規程（標準號：NY/T 2473-2013）。但SSR標記在實際使用中也暴露出一些不足，如標記數量有限、檢測位點少，位點存在一定的突變率、對變異反應比較敏感等。SNP指紋技術是繼RFLP和SSR之后發展起來的第3代標記技術，具有數量多、分布廣泛、穩定性高、易于快速且高通量地進行基因型分型等優點[8]。與 SSR相比，SNP是基于單核苷酸的突變，突變頻率更低，遺傳穩定性更高。SNP標記是構建 DNA指紋數據庫的推薦標記之一，但是目前甘藍中尚沒有基于SNP標記的指紋圖譜。因此，構建基于SNP標記技術的指紋圖譜對于甘藍品種特異性和真實性鑒別、種子純度鑒定具有重要意義。

隨著SNP檢測技術的不斷進步，SNP標記的檢測成本也逐步降低。相對于SSR標記，目前高通量大樣本的SNP標記檢測已顯現出優勢。今后隨著品種數量的增多、品種指紋圖譜數據庫的進一步豐富，高通量的SNP檢測技術在新育成品種的真實性、特異性鑒定方面將具有非常廣闊的應用前景。

3.3 利用核心標記構建SNP-DNA指紋圖譜

指紋圖譜核心標記的選擇視物種基因組的復雜程度、標記類型、標記檢測技術、品種數量等情況而定。匡猛等[29]利用36對SSR引物作為核心標記，構建了32個棉花主栽品種的指紋圖譜。王立新[30]在小麥品種鑒定中提出使用21對核心引物、84對備用引物進行指紋研究。王慶彪等[5]使用 20對核心引物構建了 50個甘藍品種的EST-SSR指紋圖譜，利用其中8對多態性較好的引物便可將50個品種全部區分開。因此對于不同物種，構建指紋圖譜的核心標記數量應視物種基因組復雜程度而定。SSR標記數量豐富、多態性高、呈共顯性，可鑒別雜合子和純合子，可用少量標記鑒別大量物種。與SSR標記不同，SNP標記雖然穩定性高但呈二態性，單個標記的多態性信息含量較低，鑒別相同數量品種所需要的標記數多于SSR標記。本研究中，篩選出了50個核心SNP位點用于主要甘藍品種的指紋圖譜構建，由于SNP標記的二態性，理論上每個標記可區分的雜交種數 N1=3，本研究中選取得50個標記可區分的最大雜交種數N=3^50=7.18×1023，出現相同指紋圖譜的概率P=1.39×10-24。因此，理論上而言，利用50個核心SNP標記構建甘藍主要品種的指紋圖譜是完全可行的。

SNP-DNA指紋圖譜的構建方式也與SNP檢測方法有關。目前常用的SNP檢測及分型的方法主要有以下幾種，基于凝膠電泳檢測的等位基因特異性PCR[31]、單鏈構象多態性[32]、酶切擴增多態性序列法[33]等；高通量自動化檢測的直接測序法、DNA芯片技術[34]、競爭性等位基因特異性PCR[17]等。等位基因特異性PCR、酶切擴增多態性序列法等SNP檢測方法由于其操作繁瑣、準確率較低，不適用于構建指紋圖譜。目前，利用 DNA 芯片技術是檢測 SNP 的最常用方法，已在玉米[14]、油菜[15]等作物的指紋圖譜構建中得到應用。利用 DNA芯片技術可直接進行指紋圖譜構建，不需要進行核心標記篩選，但該方法制作DNA指紋圖譜的成本較高。相比于DNA芯片技術，利用KASP技術進行SNP檢測的成本較低，其成本與檢測的SNP位點數呈正相關。從發展趨勢來看，近年來隨著甘藍基因組重測序的陸續開展，越來越多的SNP標記得到開發，加上SNP標記相比SSR標記的一些優勢，將來會更多地依賴于SNP標記進行品種的特異性、真實性鑒定。本研究中，利用KASP技術進行SNP檢測并篩選出50個核心SNP位點用于構建59個主要甘藍品種的指紋圖譜，隨著育種技術的發展、育成品種數量的增多，也有可能還需要增加 SNP標記，尤其是與重要農藝性狀緊密關聯的SNP標記，以更準確、高效地檢測出品種的真實性、特異性。同時，希望可以為新品種保護授權提供前期的鑒定工作，利用指紋圖譜對品種進行初步鑒定，最終結合田間表型鑒定判定品種的特異性、真實性。

4 結論

利用50份甘藍高代自交系重測序數據進行比對，共開發2.54×106個SNP位點。將442個SNP位點成功轉化為KASP標記，并從中開發出一套適用于中國甘藍品種指紋圖譜構建的核心SNP組合，構建了中國59個甘藍品種指紋圖譜數據庫。通過人工構建模擬群體驗證，證明核心SNP組合可實現對甘藍品種真實性和特異性的有效鑒定。