亞低溫促進大鼠顱腦創傷后海馬新生神經元長期存活及成熟

王晶，徐超，李曉紅，涂悅，陳翀，馬鐵柱，王麗娜，朱旭，任吉濱，許子寧，楊慧云，張賽△

顱腦創傷（traumatic brain injury，TBI）是世界范圍內嚴重的公共衛生問題，是導致我國青壯年死亡及致殘的主要原因之一，給社會和家庭帶來了沉重負擔［1］。神經發生主要包括神經干細胞（neural stem cells，NSCs）增殖、遷移、分化及存活等多個過程，內源性神經干細胞的增殖和分化使新生神經元（newborn neurons）在哺乳動物大腦中持續存在［2］。研究證實TBI后海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）區神經發生增加，神經元前體細胞在損傷側DG區聚集并整合入現有神經網絡中，海馬區新生神經元長期存活及成熟可能有助于TBI后神經功能恢復［3-4］。亞低溫（mild hypothermia，MHT）具有抑制TBI后繼發性損傷過程中某些破壞性代謝途徑的潛力，進而影響神經發生過程，發揮神經保護作用［5］。本研究旨在探討MHT是否可促進TBI后海馬DG區新生神經元細胞長期存活及成熟，進而促進TBI后神經功能恢復，以期探討MHT療法減緩TBI的有效性及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 59只SPF級成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，體質量240～280 g，均購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。采用隨機數字表法分為假手術（sham）組（n=15）、TBI組（n=22）及TBI+MHT組（n=22）。MODEL01-B液壓顱腦損傷儀由美國弗吉利亞大學醫學院研制，T1型亞低溫治療儀購于中國珠海黑馬（Hema）公司。大鼠抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）抗體、兔抗NeuN抗體（Abcam，英國）；FITC標記山羊抗大鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗、核熒光染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Invitrogen，美國）。

1.2 動物模型的建立 TBI組及TBI+MHT組動物稱體質量，5%水合氯醛（7 mL/kg）經腹腔注射麻醉，固定頭部。備皮消毒，頭皮正中切口3 cm，剝離骨膜，以前囟后3.8 mm、中線右側2.5 mm為中心，開直徑4.0 mm圓形骨窗，暴露完整硬腦膜。置內徑2.6 mm打擊管，增強型牙科磷酸鋅水門汀將打擊管固定于顱骨上，管內充滿生理鹽水，連接液壓沖擊腦損傷儀（2.0 atm，1 atm=101.325 kPa）打擊骨窗建立重型TBI模型，TBI后骨蠟止血，逐層縫合手術切口并消毒。sham組動物暴露完整硬腦膜后直接逐層縫合手術切口并消毒，不進行液壓打擊，暴露硬腦膜過程同前。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

1.3 MHT的實施 重型TBI模型建立后，立即將動物置于降溫冰毯上接受MHT治療，降溫后直腸目標溫度33.5℃，維持4 h，1.5 h內緩慢復溫至37℃。MHT治療過程中若出現呼吸抑制，立即給予經口氣管插管，采用小動物呼吸機行機械通氣直至產生自主呼吸。所有操作完成后常規喂養動物，自由飲水，白晝與夜晚各12 h，環境溫度（37±1）℃。

1.4 Morris水迷宮試驗 于造模后21～26 d連續每天訓練大鼠記憶水迷宮中隱藏平臺的能力，記錄從大鼠入水到找到平臺所需的時間，即逃避潛伏期。在造模后第28天撤去平臺，測量大鼠穿越平臺的次數及停留在目標象限中的時間。

1.5 BrdU腹腔注射 標記新生有絲分裂細胞于大鼠造模后連續5 d腹腔注射BrdU，每隔12 h注射1次，每日2次，共10次，劑量150 mg/kg，各組大鼠于造模后1、4、8周分別隨機挑選5只，進行大鼠的灌流固定及取材。

1.6 改良神經功能缺損評分評估神經功能恢復情況 TBI組及TBI+MHT組各隨機選取12只大鼠，分別于造模后1、2、4周對兩組大鼠進行神經功能缺損評分（Modified neurological severity scores，mNSS），評分由運動試驗（提尾試驗、異常活動）、感覺試驗（視覺、觸覺及本體感覺）、平衡木試驗、反射活動及異常運動組成，得分在0～18分，分值越低表示神經功能越好。

1.7 免疫熒光染色檢測大鼠海馬BrdU、NeuN表達 選取腦組織切片置于1 mol/L HCl中4℃處理10 min，2 mol/L HCl常溫處理10 min，37℃處理20 min，0.01 mol/L硼酸溶液中和10 min，PBS洗5 min× 3次；0.5%TritonX-100浸泡20 min，PBS洗5 min×3次；滴加5%BSA 100μL/片封閉，37℃孵育15 min，用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加一抗BrdU（1∶100）、NeuN（1∶200），放入濕盒后置于4℃冰箱過夜；隔日切片室溫復蘇1 h，PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃溫箱避光50 min，PBS洗5 min× 3次；滴加DAPI，PBS洗5 min× 3次，50%甘油封片。在100倍熒光顯微鏡下以損傷側海馬作為觀察區域，選取連續5張腦組織切片分別計數陽性細胞數，最后算出5張切片的平均陽性細胞數。

1.8 統計學方法 使用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理，

2 結果

2.1 Morris水迷宮試驗結果 與sham組相比，TBI組大鼠的逃避潛伏期顯著延長，平臺穿越次數及目標象限停留時間均明顯減少（P＜0.01）。與TBI組相比，TBI+MHT組大鼠的逃避潛伏期縮短（P＜0.05），平臺穿越次數及目標象限停留時間均增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the results of Morris water maze test between three groups表1 各組Morris水迷宮試驗結果比較 （n=12,±s）

Tab.1 Comparison of the results of Morris water maze test between three groups表1 各組Morris水迷宮試驗結果比較 （n=12,±s）

＊＊P＜0.01；a與sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05

組別sham組TBI組TBI+MHT組F逃避潛伏期（s）8.243±2.663 19.384±4.730a 14.640±3.036ab 26.670＊＊平臺穿越次數（次）4.667±1.179 1.833±0.687a 3.333±0.850ab 25.670＊＊目標象限停留時間（s）33.066±5.558 19.882±5.170a 25.538±3.896ab 19.830＊＊

2.2 TBI組及TBI+MHT組mNSS評分比較 因sham組大鼠神經功能無缺損過程，實驗進行mNSS評分的目的在于比較大鼠神經功能缺損后的恢復情況，因此未將sham組納入比較。與TBI組比較，TBI+MHT組大鼠的mNSS評分在損傷后1、2及4周均降低（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of modified neurological severity scores between TBI group and TBI+MHT group表2 TBI組及TBI+MHT組mNSS評分比較（n=12，分，±s）

Tab.2 Comparison of modified neurological severity scores between TBI group and TBI+MHT group表2 TBI組及TBI+MHT組mNSS評分比較（n=12，分，±s）

＊＊P＜0.01

組別TBI組TBI+MHT組t傷后1周7.083±0.954 5.250±1.010 4.376＊＊傷后2周5.250±0.829 3.250±0.722 6.034＊＊傷后4周3.833±0.553 2.500±1.190 3.588＊＊

2.3 損傷后各組BrdU免疫熒光染色結果 與sham組相比，損傷后1、4、8周TBI組和TBI+MHT組大鼠損傷側海馬齒狀回區BrdU陽性細胞均增加，且TBI+MHT組較TBI組顯著增加（P＜0.05）。此外，TBI組BrdU陽性細胞在損傷后4周及8周較損傷后1周均減少，損傷后8周較損傷后4周減少（P＜0.05），而TBI+MHT組在損傷后4周較損傷后1周進一步增加（P＜0.05），損傷后8周較損傷后1周及4周無差異，見表3。

2.4 損傷后各組BrdU/NeuN雙標記免疫熒光染色結果 損傷后1、4、8周，TBI組及TBI+MHT組大鼠損傷側海馬DG區BrdU/NeuN雙標記陽性細胞從顆粒下層（SGZ）逐漸向顆粒細胞層（GCL）移位，見圖1。傷后各時間點TBI組及TBI+MHT組BrdU/NeuN雙陽性細胞數均較sham組增加，且與TBI組比較，TBI+MHT組雙陽性細胞數在各時間點均顯著增加（P＜0.05）。此外，與損傷后1周相比，TBI組損傷后4周及8周BrdU/NeuN雙陽性細胞數減少，而TBI+MHT組雙陽性細胞數增加，該兩組損傷后8周與損傷后4周比較均無差異，見表4。

Fig.1 Double immunostaining of BrdU/NeuN in injured hippocampus of three groups at each time point after injury(×100)圖1 傷后各時間點各組損傷側海馬Brdu/NeuN雙標記免疫熒光染色結果（×100）

Tab.3 Comparison of BrdU-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表3 傷后1周、4周及8周各組損傷側海馬BrdU陽性細胞表達數比較 （n=5，個，±s）

Tab.3 Comparison of BrdU-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表3 傷后1周、4周及8周各組損傷側海馬BrdU陽性細胞表達數比較 （n=5，個，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與sham組比較，b與TBI組比較，A與傷后1周比較，B與傷后4周比較，P＜0.05

組別sham組TBI組TBI+MHT組F傷后1周9.20±1.17 32.80±4.75a 44.40±5.54ab 70.770＊＊傷后4周8.80±3.25 22.80±6.11aA 54.20±10.38abA 41.660＊＊傷后8周5.20±3.54 16.40±3.14aAB 42.20±10.76ab 35.720＊＊F 2.379 11.750＊＊5.976＊

Tab.4 Comparison of Brdu/NeuN double-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表4 傷后1周、4周及8周各組損傷側海馬Brdu/NeuN雙標記細胞表達數比較 （n=5，個，±s）

Tab.4 Comparison of Brdu/NeuN double-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表4 傷后1周、4周及8周各組損傷側海馬Brdu/NeuN雙標記細胞表達數比較 （n=5，個，±s）

＊＊P＜0.01；a與sham組比較，b與TBI組比較，A與傷后1周比較，P＜0.05

組別sham組TBI組TBI+MHT組F傷后1周1.088±0.413 8.800±2.638a 13.200±1.166ab 53.341＊＊傷后4周0.622±0.457 4.800±1.600aA 17.200±2.135abA 122.417＊＊傷后8周0.478±0.391 2.800±0.748aA 17.200±1.720abA 270.351＊＊F 2.862 11.110＊＊7.207＊＊

3 討論

3.1 MHT可促進TBI后神經功能缺損的修復 TBI是耗費社會成本的重大健康問題，TBI后很多患者出現偏癱、失語及記憶力減退等神經功能缺損及預后不良表現，目前尚無十分有效的治療方法［6］。海馬區是神經發生的重要部位，與大腦學習記憶等功能密切相關，而DG區是海馬的關鍵性組成部分，因此研究TBI誘導的海馬DG區神經發生對海馬功能及神經功能缺損修復的潛在影響十分必要。TBI后神經功能缺損涉及多種病理機制，有效的治療應是指能夠抑制繼發性損傷并擴大內源性神經可塑性的治療［7-8］。MHT是一種應用藥物或物理方法使患者體溫下降至目標溫度，以達到治療目的的治療方法。20世紀90年代至今，MHT治療TBI逐漸被研究者及臨床工作者所關注，但療效仍存在爭議。研究已證實，MHT可通過多種神經保護機制抑制TBI后繼發性腦損傷過程，如降低腦耗氧量、抑制乳酸堆積、降低顱內壓、維持正常腦代謝等從而降低TBI患者的病死率，改善神經功能預后［9］。但也有研究報道MHT對TBI患者神經功能預后可能無影響甚至可導致預后不良［10］。本研究顯示MHT可引起大鼠逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數及目標象限停留時間增加、mNSS評分降低，表明MHT可促進TBI大鼠的學習及記憶功能恢復，減輕TBI后神經功能缺損，并促進TBI后神經功能缺損恢復。

3.2 TBI后海馬DG區神經發生增加但并不持久 神經發生主要存在于成年哺乳動物大腦的兩個區域：腦室下區（SVZ）及海馬DG區［3］，研究TBI后海馬神經發生過程對進一步認識TBI后腦及神經功能變化十分必要。成體海馬神經發生是新生功能性神經元整合入海馬DG區現有回路的過程，由多個層次的病理生理活動共同調控，包括成體NSCs或前體神經細胞增殖、祖細胞分化及新生神經元存活和成熟等［3，11］。成體NSCs是神經系統中一類可以自我更新并向各個類型神經細胞分化的細胞。盡管研究已證實TBI后新生神經元細胞及成體NSCs會大量增殖［12］，但TBI對神經發生的影響仍存在爭議。有研究表明，TBI后神經發生增加［13-14］；有研究則表明TBI后神經發生并未發生變化［15］；還有研究報道TBI后神經發生減少［16］。為了明確TBI后神經發生的變化，本研究將核苷酸類似物BrdU作為細胞示蹤劑引入有絲分裂細胞，結果顯示TBI在損傷后1周促進海馬DG區NSCs的“爆發性”增殖，但并不持久（未持續至損傷后4周及8周）。

3.3 MHT可促進TBI后海馬DG區長期持續性神經發生 神經細胞生成階段及新生神經元整合階段是海馬DG區神經發生的兩個關鍵性時期。有研究表明，神經發生作用對海馬功能可塑性具有重要意義［17］，不能進一步發育為成熟神經元的新生神經元細胞將會在新生后1周內死亡［18-19］。因此，在出現后進一步發育為成神經細胞或成熟神經元對TBT后海馬DG區新生細胞存活至關重要。已有研究證實，成年大鼠海馬DG區SGZ層增殖的前體細胞可形成中間祖細胞，進而生成成神經細胞，成神經細胞可逐漸發育為成熟神經元細胞并部分遷移至海馬DG區GCL層，進而影響神經突觸形成和神經傳導［20］。但MHT是否會增加TBI后海馬DG區神經發生、并影響內源性神經可塑性，改善新生神經元長期存活及成熟目前尚無定論。因此，為研究MHT對TBI海馬DG區神經再生的影響，本實驗通過免疫熒光法檢測損傷側海馬DG區新生細胞（BrdU標記）中成熟神經元（NeuN標記）的表達情況，結果顯示，在損傷后各時間點，TBI組和TBI+MHT組大鼠損傷側海馬DG區新生及成熟神經元細胞均增加，且TBI+MHT組較TBI組增加更明顯，兩組新生神經元細胞均從SGZ層逐漸向GCL層移位并逐漸成熟；且與損傷早期（1周）相比，損傷后期（4周及8周）TBI組成熟神經元細胞減少，而TBI+MHT組則進一步增加。這些都表明TBI僅能促進腦創傷后新生神經細胞的大量增殖及短期存活，而MHT可促進TBI后海馬DG區新生神經細胞的長期存活及成熟。

綜上所述，MHT可通過誘導顱腦創傷后新生神經元細胞的長期存活及成熟來促進TBI后大鼠神經功能恢復，為TBI內源性治療提供潛在策略。