lncRNA UCA1在肝癌中的表達及對肝癌HepG2細胞增殖和侵襲的作用及機制

王海博，李忠廉

肝癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、預后差，具有很強的侵襲和轉(zhuǎn)移力［1］。盡管目前肝癌發(fā)生、發(fā)展相關機制的研究已有很多，但是其病因及發(fā)病機制尚未明確［2］。因此，探尋調(diào)控肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子標志物對揭示肝癌的生物學行為及抑制其惡性進展至關重要。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，可作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［3-4］。近年研究顯示，lncRNA UCA1在多種惡性腫瘤細胞中表達，提示其可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有關［5-7］。本研究采用已構(gòu)建的lncRNA UCA1短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒，旨在探討lncRNA UCA1基因沉默后對人肝癌HepG2細胞增殖和侵襲的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 肝癌和癌旁組織標本各20例均來自天津市南開醫(yī)院2015年11月—2017年5月行肝癌手術(shù)患者，男10例，女10例，年齡47～62歲，平均（56.3±6.8）歲。患者均于術(shù)后病理證實為肝細胞癌。標本的收集及使用得到天津市南開醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 人肝癌細胞HepG2購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol和Lipofectamine 2000（美國Life Technologies公司）；CCK-8試劑盒、細胞蛋白抽提試劑盒和超敏化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Real-time PCR Master Mix（大連寶生物工程公司）；Matrigel基質(zhì)和Transwell小室（美國Corning公司）；細胞周期蛋白（Cyclin）D1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、黏著斑激酶（FAK）和整合素（Integrin）β3一抗以及二抗（美國Santa Cruz公司），β-actin單克隆抗體（Sigma公司）；引物合成和純化（六合華大基因科技股份有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。OLYMPUSBX51光學顯微鏡（日本Olympus公司），ABI 7500熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。根據(jù)靶向lncRNA UCA1序列的不同區(qū)域，本研究設計了2種shRNA質(zhì)粒（pcDNA3.1 vector）。引物序列見表1。

將對數(shù)生長期的HepG2細胞以3×106個/mL加入6孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)過夜，通過轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000按照說明書方法分別轉(zhuǎn)染lncRNA UCA1 shRNA質(zhì)粒1和lncRNA UCA1 shRNA質(zhì)粒2，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)48 h進行后續(xù)實驗。不轉(zhuǎn)染細胞作為Control組。

1.4 CCK-8實驗檢測lncRNA UCA1 shRNA對細胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染后的細胞以2×103個/mL接種到96孔微孔板中，每孔100μL，每組設置5個復孔，培養(yǎng)過夜使細胞貼壁，培養(yǎng)72h后按照CCK-8試劑盒說明書的要求每孔加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。最后用酶標儀測定450 nm波長下的光密度（OD）值。

Tab.1 shRNA plasmid primer sequence表1 shRNA質(zhì)粒引物序列

1.5 體外侵襲實驗檢測lncRNA UCA1 shRNA對細胞侵襲能力的影響 HepG2細胞轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰酶-EDTA消化后無血清RPMI-1640制備細胞懸液，1×105個細胞加入預先鋪好100μL Matrigel基質(zhì)的transwell上室中，下室中加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出小室，棉簽擦掉上室未透過聚碳酯膜的Matrigel膠和細胞，4%多聚甲醛固定膜10 min，結(jié)晶紫染色20 min，高倍鏡下隨機計數(shù)5個視野中的細胞數(shù)，以細胞數(shù)代表腫瘤細胞的侵襲能力。

1.6 細胞劃痕實驗檢測lncRNA UCA1 shRNA對細胞遷移能力的影響 HepG2細胞于6孔板中分別轉(zhuǎn)染lncRNA UCA1 shRNA質(zhì)粒1/2 48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)直至形成單層融合。無血清饑餓培養(yǎng)過夜，然后利用200μL吸頭在細胞層中形成劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，顯微鏡觀察并統(tǒng)計劃痕的間隙距離。

1.7 Western blot實驗檢測lncRNA UCA1 shRNA對細胞腫瘤相關基因蛋白表達的影響 HepG2細胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用RIPA裂解液進行裂解，加入40μg蛋白樣品，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（150 mA，1 h），5%脫脂牛奶封閉1 h后，Cyclin D1（1∶2 000）、VEGF（1∶2 000）、MMP-9（1∶2 000）、FAK（1∶2 000）和Integrin β3（1∶2 000）特異性抗體（一抗）4℃孵育過夜。洗去一抗，以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，洗滌，以化學發(fā)光試劑盒顯示免疫反應條帶。β-actin（1∶5 000）作為內(nèi)參，檢測細胞中Cyclin D1、VEGF、MMP-9、FAK和Integrin β3的表達水平。

1.8 Real-time PCR檢測lncRNA UCA1 shRNA對細胞中l(wèi)ncRNA UCA1和腫瘤相關基因mRNA表達的影響 所有組織標本活檢后均經(jīng)病理學診斷確認。收集后立即置于液氮中，于-80℃保存。HepG2細胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用Trizol法提取組織及細胞的總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度，然后據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。以GAPDH作為內(nèi)參，在熒光定量PCR儀上以SYBR Green I染料檢測靶基因的表達情況。將所擴增的PCR產(chǎn)物進行熔解曲線分析，同時隨機進行體積分數(shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳分析，以確定產(chǎn)物是否為所擴增的目的片段。采用2-△△Ct法分析各個樣品的基因相對表達差異，引物序列見表2。反應條件：95 ℃預變性3 min；95℃ 15 s，60℃ 20 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)；72℃延伸5 min。

Tab.2 Real-time PCR primer sequence表2 Real-time PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA UCA1在肝癌組織中的表達結(jié)果 與癌旁組織相比，肝癌組織lncRNA UCA1的表達水平顯著上升（1.000±0.287vs.0.553±0.122，t=6.409，P＜0.05）。

2.2 shRNA沉默HepG2細胞中l(wèi)ncRNA UCA1的表達 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與Control組（1.000±0.112）相比，lncRNA UCA1 shRNA 質(zhì)粒1（0.673±0.057）和 lncRNA UCA1 shRNA 質(zhì) 粒 2（0.545±0.053）干擾后，2組HepG2細胞中l(wèi)ncRNA UCA1的表達水平均顯著下降（F=44.403，P＜0.01）。

2.3 沉默lncRNA UCA1表達對HepG2細胞生長的影響 CCK-8結(jié)果顯示，lncRNA UCA1表達沉默后，HepG2細胞的體外增殖受到顯著抑制，見表3。

2.4 沉默lncRNA UCA1表達對細胞侵襲和遷移的影響 Transwell實驗顯示，沉默lncRNA UCA1表達后，細胞侵襲能力明顯下降，表明lncRNA UCA1影響HepG2細胞的體外侵襲能力。而劃痕實驗同樣顯示，Control組的劃痕寬度顯著減小，沉默lncRNA UCA1表達后，lncRNA UCA1 shRNA1和 lncRNA UCA1 shRNA2的劃痕愈合受到顯著抑制，見圖1、表4。

Tab.3 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the proliferation in HepG2 cells in vitro表3 沉默lncRNA UCA1表達對HepG2細胞體外增殖的影響 （n=5，OD值，±s）

Tab.3 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the proliferation in HepG2 cells in vitro表3 沉默lncRNA UCA1表達對HepG2細胞體外增殖的影響 （n=5，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與shRNA1組比較，P＜0.05

組別Control組shRNA1組shRNA2組F 24 h 0.252±0.022 0.214±0.025a 0.181±0.012ab 15.112＊＊48 h 0.552±0.041 0.431±0.042a 0.383±0.035ab 24.361＊＊72 h 1.221±0.130 0.741±0.063a 0.623±0.052ab 63.842＊＊

Fig.1 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the invasion and migration in HepG2 cells in vitro圖1 沉默lncRNA UCA1表達對細胞侵襲和遷移的影響

Tab.4 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the invasion and migration in HepG2 cells in vitro表4 沉默lncRNA UCA1表達對HepG2細胞體外侵襲和遷移的影響 （n=3，±s）

Tab.4 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the invasion and migration in HepG2 cells in vitro表4 沉默lncRNA UCA1表達對HepG2細胞體外侵襲和遷移的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與shRNA1組比較，P＜0.05

組別Control組shRNA1組shRNA2組F侵襲細胞數(shù)（個）58.7±12.5 31.2±8.2a 27.8±7.3ab 9.336＊細胞愈合率（%）67.3±5.4 42.6±5.7a 32.3±3.5ab 39.421＊＊

2.5 沉默lncRNA UCA1表達對Cyclin D1、VEGF、MMP-9、FAK和Integrin β3表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，沉默lncRNA UCA1表達后細胞中的Cyclin D1、VEGF、MMP-9、FAK和Integrin β3的表達水平顯著下降，見表5、圖2。

Fig.2 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the protein expression of Cyclin D1,VEGF,MMP-9,FAK and Integrin β3 in HepG2 cells圖2 沉默lncRNA UCA1表達對Cyclin D1、VEGF、MMP-9、FAK和Integrin β3蛋白表達的影響

3 討論

LncRNAs已經(jīng)被證明參與包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，本研究通過分析lncRNA UCA1在肝癌中的表達和作用，深入探索肝癌發(fā)病的分子機制。

3.1 lncRNA UCA1在肝癌組織中高表達 研究發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1在多種腫瘤組織中表達，并且與其惡性程度及患者預后密切相關［8］，提示lncRNA UCA1在腫瘤細胞的生存與發(fā)展過程中起著重要作用。本研究首先利用Real-time PCR檢測了肝癌患者的癌組織和對應的癌旁組織中l(wèi)ncRNA UCA1表達，結(jié)果顯示lncRNA UCA1在肝癌組織中高表達，提示lncRNA UCA1可作為潛在的腫瘤標志物并可能在肝癌增殖和侵襲等生物學行為中具有調(diào)控作用。

3.2 lncRNA UCA1沉默對HepG2細胞的抑制作用和機制 HepG2細胞株是一種分化型肝癌細胞。本研究顯示，shRNA沉默lncRNA UCA1后，HepG2細胞的體外增殖、侵襲和遷移能力均顯著下降。因此，本研究通過Western blot和Real-time PCR實驗進一步分析lncRNA UCA1抑制肝癌的分子機制。

Tab.5 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the mRNA expression of Cyclin D1,VEGF,MMP-9,FAK and Integrin β3 in HepG2 cells表5 沉默lncRNA UCA1表達對Cyclin D1、VEGF、MMP-9、FAK和Integrin β3的mRNA表達的影響 （n=5，±s）

Tab.5 The effect of lncRNA UCA1 silencing on the mRNA expression of Cyclin D1,VEGF,MMP-9,FAK and Integrin β3 in HepG2 cells表5 沉默lncRNA UCA1表達對Cyclin D1、VEGF、MMP-9、FAK和Integrin β3的mRNA表達的影響 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與shRNA1組比較，P＜0.05

組別Control組shRNA1組shRNA2組F基因Cyclin D1 1.000±0.067 0.726±0.052a 0.687±0.042ab 48.722＊＊VEGF 1.000±0.081 0.656±0.048a 0.553±0.035ab 81.461＊＊MMP-9 1.000±0.062 0.727±0.046a 0.611±0.035ab 83.274＊＊FAK 1.000±0.072 0.814±0.057a 0.659±0.046ab 41.453＊＊Integrin β3 1.000±0.065 0.787±0.051a 0.577±0.031ab 86.171＊＊

Cyclin D1是調(diào)控細胞周期G1期向S期過渡的關鍵分子，參與細胞的增殖和凋亡，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切［9］。VEGF目前被認為是促進某些腫瘤淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素之一。Cyclin D1被認為可通過調(diào)控VEGF來影響腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲，兩者均在腫瘤的血管新生過程中發(fā)揮關鍵調(diào)節(jié)作用并與患者預后不良有關［10-11］。本研究中發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA UCA1表達后，Cyclin D1和VEGF表達水平均明顯下調(diào)，提示Cyclin D1和VEGF在lncRNA UCA1調(diào)控肝癌細胞增殖中發(fā)揮作用。MMP-9是降解細胞外基質(zhì)和基底膜的重要基質(zhì)金屬蛋白酶之一，是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中重要的調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)展中起關鍵作用［12］。本研究中發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA UCA1表達后，MMP-9表達水平均明顯下調(diào)，表明lncRNA UCA1可能通過調(diào)控MMP-9而參與調(diào)控肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

3.3 lncRNA UCA1對Integrin β3-FAK通路的調(diào)控作用 Integrin β3-FAK通路在細胞增殖、形態(tài)改變以及運動過程中具有重要作用，可通過上調(diào)Cyclin D1表達使細胞獲得侵襲表型。FAK是整合蛋白介導的信號轉(zhuǎn)導通路中的重要成員，在腫瘤向惡性侵襲表型演進的過程中起著重要的作用［13］。Integrin β3是介導細胞與細胞間的相互作用及細胞與細胞外基質(zhì)間相互作用的細胞黏附分子［14］，可介導并激活FAK，從而調(diào)控腫瘤細胞的黏附和遷移［15］。本研究發(fā)現(xiàn)沉默lncRNA UCA1表達可下調(diào)HepG2細胞中Integrin β3和FAK表達，提示lncRNA UCA1可能通過Integrin β3-FAK信號途徑調(diào)控肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究顯示lncRNA UCA1在肝癌組織中異常高表達，在肝癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，沉默lncRNA UCA1可抑制肝癌細胞的體外生長、侵襲和遷移，其機制可能涉及Integrin β3-FAK信號途徑，并調(diào)控Cyclin D1、VEGF和MMP-9的表達。lncRNA UCA1核苷酸序列較長，本研究根據(jù)不同序列區(qū)域設計了2種shRNA質(zhì)粒，并發(fā)現(xiàn)上述shRNA質(zhì)粒均可有效抑制HepG2細胞體外增殖和侵襲，但是靶向不同區(qū)域?qū)δ[瘤細胞的抑制效果不同，本課題組將在今后的研究中進一步探討其機制。