miR-106a-5p及其靶基因在結腸癌患者手術前后的表達差異及臨床意義*

田 衍，舒 若，曾玉劍，王昆華，羅華友

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院胃腸與疝外科，昆明 650032;2.云南省消化病研究所,昆明 650032；

3.昆明醫科大學第一附屬醫院云南省工程技術研究中心,昆明 650032；

4.昆明醫科大學第一附屬醫院昆明市消化病工程技術研究中心,昆明 650032)

近年來，參與調節基因表達的微小RNA (miRNA)在癌癥研究方面取得了許多新的進展，并證實其參與了多種腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等過程。結腸癌是世界范圍內病死率位居前三的惡性腫瘤，其發病機制仍不明確。目前，結腸癌的治療主要依賴于完整系膜切除術(CME)這類外科手術[1-2]。但是，結腸癌患者術后局部復發和遠處轉移情況時有發生，生存率也十分堪憂。近期研究表明，miRNA在結腸癌的早期診斷、治療預后和生物靶標等方面可能存在潛在的臨床價值[3-5]。miR-106a-5p作為miR-17家族的一員，在胃癌[6-7]、大腸癌[8-9]、結直腸癌[10-11]、食管鱗癌[12]、卵巢癌[13]和乳腺癌[14]等腫瘤的相關研究中均有報道。新近研究還發現了一些miR-106a-5p的新靶向基因，如長鏈非編碼RNA FER1L4[15-16]、轉化生長因子Ⅱ型受體(TGFBR2)[17-18]、Fas激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶(FASTK)[19]和磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)[20-21]等。本研究比較分析miR-106a-5p及其靶基因在結腸癌患者和健康人群血漿中的表達水平差異，以及行CME手術后在結腸癌患者血漿中的表達變化，旨在為結腸癌的臨床診斷和治療提供一些參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年8月至2014年8月在昆明醫科大學第一附屬醫院接接受CME治療的結腸癌患者100例作為實驗組，術前均未行放療或化療。同時選取100例健康志愿者作為對照組。實驗組平均年齡(57.21±8.74)歲，其中男53例，女47例。對照組平均年齡(55.02±7.95)歲，其中男48例，女52例。兩組人群的年齡和性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血漿采集 靜脈抽取實驗組手術前血液，手術后第7天血液，對照組血液各2 mL。血液標本快速轉入乙二胺四乙酸(EDTA)采血管，室溫靜置約30 min后，4 ℃下1 200×g離心10 min，轉移上清液至新的離心管。然后，4 ℃下12 000×g離心10 min，去除細胞成分，收集上層血漿至新的離心管，-80 ℃保存備用。

1.2.2血漿總RNA提取及逆轉錄 各取200 μL上述血漿樣本，按GenEluteTMPlasma/Serum RNA Purification Mini Kit (SIGMA-ALDRICH)的方法步驟抽提血漿中的總RNA，利用熒光分光光度計(Thermo Fisher)測定血漿RNA濃度。提取的RNA置于-80℃保存備用。參照Taq-Man miRNA Reverse Transcription試劑盒(Applied BioSystems)的說明合成cDNA。

1.2.3RT-qPCR檢測 利用SYBR Master mix 試劑盒(Toyobo)在ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Applied BioSystems)上對上述合成的cDNA進行RT-qPCR檢測。每個反應重復3次。待檢測mRNA或基因的引物序列見表1。以U6小環RNA作為內參[22-23]，結果采用2-△△Ct相對定量法計算[24]。

1.3CME手術方法及術后隨訪 結腸癌患者遵循CME結腸癌根治原則進行手術治療[1-2]。分別按miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的相對表達水平將結腸癌患者劃分為高值組和低值組。相對表達水平大于或等于平均相對表達水平的患者歸為高值組，相對表達值小于平均相對表達值的患者歸為低值組。術后3年內平均每3個月隨訪1次，記錄高值組與低值組腫瘤局部復發、遠處轉移和患者死亡等情況。

表1 用于RT-qPCR檢測用的引物序列

2 結 果

2.1結腸癌患者手術前后miR-106a-5p及其靶基因的表達量比較 在實施手術前，實驗組結腸癌患者血液中miR-106a-5p的表達量顯著高于對照組，而結腸癌患者血液中FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表達量則顯著低于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.01)。行CME后，miR-106a-5p的表達量顯著下調(P<0.01)，而FER1L4、TGFBR2和FASTK的表達量則顯著上調(P<0.05)，PTEN的表達變化差異無統計學意義。見圖1。

2.2結腸癌患者血漿中miR-106a-5p及其靶基因的表達與臨床病理特征的關系 結腸癌患者血漿中miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的相對表達量與性別、年齡和腫瘤發生部位均無關，見表2。miR-106a-5p與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關(P<0.05)；FER1L4與分化程度和淋巴結轉移有關(P<0.05)；TGFBR2與分化程度和遠處轉移有關(P<0.05)；FASTK與淋巴結轉移有關(P<0.05)；PTEN與腫瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關(P<0.05)。

圖1兩組血液中miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表達量

表2 結腸癌臨床病理特征與miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的相對表達量

2.3高值組和低值組結腸癌患者復發率和生存率比較 miR-106a-5p低值組患者的復發率低于高值組(P<0.05)，生存率優于高值組，但差異無統計學意義(P>0.05)。FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的高值組患者的復發率低于低值組，生存率優于低值組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 miR-106a-5p及其靶基因的表達與復發率和生存率的關系

3 討 論

結腸癌的發病需要經歷不典型增生、腺瘤、癌變及腫瘤轉移等過程，miRNA及其靶基因在每一個階段均表現出差異的表達模式。研究miRNA與靶基因之間的相互調控關系，可以了解腫瘤的發生機制，為癌癥治療提供新的靶點[4-5]。目前，在結腸癌方面研究較多的miRNA主要是miR-21[22]和miR-106a[18,25]。而在胃癌和結直腸癌等癌癥報道中，miR-106a可能與抑癌基因FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN等存在相互調控關系[15,18-19]。

本研究利用RT-qPCR技術對miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN在結腸癌患者血漿中的表達進行了檢測。結果顯示，實驗組結腸癌患者手術前血漿中miR-106a-5p的表達顯著高于對照組，而FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表達顯著低于對照組。這與它們分別在胃癌和結直腸癌等癌癥中的表達情況基本類似[8-9]。實驗組結腸癌患者行CME手術后，檢測其血漿中miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表達量，結果顯示，術后miR-106a-5p的表達量比術前顯著下調(P<0.01)，術后FER1L4、TGFBR2和FASTK的表達量比術前顯著上調(P<0.05)。這說明miR-106a-5p與抑癌基因FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN的表達水平是負調控關系，與之前報道的miR-106a-5p與FER1L4在腫瘤組織中競爭表達的結果是一致的[15-16]。這些結果說明miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN可能參與了結腸癌的發生和發展等過程。

本研究進一步分析了miR-106a-5p及其靶基因的表達量與臨床病理特征的關系。結果顯示，miR-106a-5p、FER1L4、TGFBR2和FASTK的相對表達量與患者性別、年齡、腫瘤發生部位和腫瘤大小均無關(P>0.05)，只有PTEN的相對表達量與腫瘤大小可能有一定的相關性(P<0.05)。miR-106a-5p的相對表達量與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移均有關(P<0.05)。其余4個靶基因的相對表達量則主要與分化程度(FER1L4、TGFBR2和PTEN)和淋巴結轉移(FER1L4、FASTK和PTEN)有關(P<0.05)。按相對表達量分組分析結果顯示，miR-106a-5p低表達組的術后復發率低，生存率高；FER1L4、TGFBR2、FASTK和PTEN高表達組的術后復發率低，生存率高。以上分析表明，miR-106a-5p及其靶基因具有作為檢測腫瘤生物標志物的潛力[25]。由于無創、穩定性好、檢測結果可靠等特點[26]，對miR-106a-5p及其靶基因的檢測可能有助于結腸癌的早期診斷、輔助治療和患者預后。