棘腹蛙TGF-α基因的克隆與組織表達(dá)分析

鄒 勇， 李曉英,2， 羅 潔 ,2， 樊汶樵,2

(1.重慶文理學(xué)院,重慶 永川 402168 ； 2.重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心,重慶 永川 402168)

轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor，TGF)超基因家族因?yàn)樵诩?xì)胞發(fā)育、表皮形成、組織修復(fù)、癌癥發(fā)生和免疫等方面發(fā)揮的重要作用，一直以來都是研究的熱點(diǎn)[1]。TGF-α被發(fā)現(xiàn)參與癌癥的轉(zhuǎn)移與分化[2-3]，通過調(diào)控TGF-α的表達(dá)量，可以控制星形膠質(zhì)細(xì)胞的形成[4]；TGF-α和表皮生長因子受體(EGFR)共同作用，可增強(qiáng)流感病毒感染時(shí)機(jī)體的先天免疫反應(yīng)[5]。

棘腹蛙(Paaboulengeri)又名石坑、石蛙等，屬無尾目、蛙科、棘蛙屬，是我國西部中高海拔區(qū)域特有的珍稀兩棲動(dòng)物[6-7]。由于環(huán)境污染、生態(tài)破壞等原因，野生棘腹蛙的規(guī)模日趨萎縮，現(xiàn)已被《中國瀕危物種紅皮書》[8]、《中國物種紅色目錄》[9]等收錄。為保護(hù)資源和滿足經(jīng)濟(jì)需求，棘腹蛙人工養(yǎng)殖日漸火熱，人工飼養(yǎng)的子二代市場價(jià)格達(dá)180～280元/kg，已成為山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要途徑。

本研究擬從前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的信息入手，克隆TGF-α基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析并了解其組織表達(dá)特性；為深入了解TGF家族的特征，尤其是物種特異性的潛在功能作用位點(diǎn)，探索棘腹蛙的生理反應(yīng)和機(jī)體免疫機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑和耗材 2歲齡健康棘腹蛙，飼養(yǎng)于重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護(hù)與開發(fā)研究中心兩棲動(dòng)物流水養(yǎng)殖系統(tǒng)。TRIZol、DEPC，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，cDNA合成試劑盒、Taq酶、PCR純化試劑盒采，購自Promega公司；凝膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；DL-2 000 DNA；Marker,購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 基因序列主要基于前期本實(shí)驗(yàn)室建立的棘腹蛙蝌蚪的Illumina solexa第二高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用RT-PCR獲取棘腹蛙TGF-α的全長基因序列(上下游引物序列：5′- TGGTATTTGGTTTTCATCATTGGCT -3′， 5′- GAGCATTCAAAGAACAATCAAACCC -3′)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 序列驗(yàn)證 小心摘取棘腹蛙皮膚組織，立即放入液氮中。隨后按試劑盒說明書抽提總RNA，并利用cDNA合成試劑盒說明書完成cDNA的制備。利用TaqDNA酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。陽性產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索其他物種TGF-α同源序列，利用ClustalX 1.83對(duì)陽性測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.4 組織表達(dá)分析 根據(jù)陽性克隆的TGF-α序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物(上游引物：5′-GGGGTGACTTGTCCATC-3′，下游引物：5′-CACTGCCGCTGCTACTG-3′)，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自測(cè)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β-Actin特異性引物(上游引物：5′-CTGTGCCAATCTATGAGGG-3′，下游引物：5′-CGGCTGTGGTGGTGAAG-3′)。以在21 ℃環(huán)境下適應(yīng)生長30 d的棘腹蛙組織(皮膚、血液、胃臟、肝臟、膽囊和腸道)cDNA為模版，利用Real-time PCR(LightCycler Nano System，Roche，德國)分別擴(kuò)增TGF-α和β-Actin，檢測(cè)TGF-α在各組織中的相對(duì)表達(dá)量。

根據(jù)熒光定量試劑盒(Faststar essential DNA Green Master，Roche，德國)說明書配制20 μL 的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，52 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-α-Pb基因的擴(kuò)增 棘腹蛙TGF-α基因(TGF-α-Pb) cDNA全長序列及推測(cè)編碼的氨基酸序列見圖1。cDNA全長1 021 bp，包括188 bp的5′非翻譯區(qū)，486 bp的開放閱讀框及347 bp的3′非翻譯區(qū)；開放閱讀框編碼161個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為17.28 kDa，等電點(diǎn)為6.27。

2.2 氨基酸序列比對(duì) 將TGF-α-Pb的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物TGF-α的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和多序列比對(duì)，結(jié)果見圖 2。分析表明，TGF-α-Pb與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)TGF-α的相似性最高，為73%；與熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)、西部錦龜(Chrysemyspictabellii)、鬼狒(Mandrillusleucophaeus)、 家兔(Oryctolaguscuniculus)、人(Homosapiens)和水牛(Bubalusbubalis)的 同 源 性 分 別 為 71%、71%、71%、67%、69% 和65%。

圖1TGF-α-PbcDNA全長序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列分析

注：開放閱讀框486bp，編碼161個(gè)氨基酸。起始密碼子和終止密碼子分別用黑體單下劃線和黑體雙下劃線表示

圖2棘腹蛙與其他物種TGF-α氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

注：比對(duì)所用到的物種和 GenBank 登錄號(hào)： 虹鱒，XP_011822612.1；人，AAF05091.1； 家兔，XP_008252499.1； 水牛，XP_006049306.1；西部錦龜，XP_005285272.1； 非洲爪蟾，NP_001088773.1；熱帶爪蟾，XP_002935348.1

2.3TGF-α-Pb在不同組織的差異表達(dá) 用相對(duì)定量PCR的方法分別檢測(cè)了TGF-α-Pb在皮膚、血液、胃臟、肝臟、膽囊和腸道組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，TGF-α-Pb在各組織中均有表達(dá)，在肝臟和胃臟中的表達(dá)量較高，在腸道、皮膚和血液中的表達(dá)量相對(duì)較低，結(jié)果見圖3。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆了棘腹蛙TGF-α基因的全長cDNA序列，對(duì)其氨基酸序列通過多序列比較發(fā)現(xiàn)，其與其他物種TGF-α相似性相對(duì)較低，顯示出該基因在進(jìn)化上的特異性。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)該基因在皮膚、血液和主要消化器官中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肝臟和胃中有該基因相對(duì)表達(dá)量較高，可能是該基因編碼蛋白產(chǎn)生作用的主要靶器官。

圖3TGF-α-Pb在不同組織中的差異表達(dá)量