致蛋雞髓細胞瘤型ALV-A病毒株的分離與鑒定

熊 瑛， 王 瑩， 李長風， 梁雄燕， 楊玉瑩， 顧玉芳

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州434025)

禽白血病是由禽白血病病毒引起的嚴重危害我國養雞業的重要腫瘤性疾病。不同亞群的禽白血病病毒可以引起雞淋巴細胞瘤、髓細胞瘤、血管瘤、成紅細胞瘤等多種類型腫瘤發生，A、B亞群主要引起雞經典的淋巴細胞瘤，J亞群禽白血病病毒主要引起髓細胞瘤、血管瘤為主的腫瘤[1]。過去十幾年給我國養雞業造成了巨大威脅，而其他亞群的禽白血病病毒引起病例報道較少。

近年來，隨著各種外在條件的變化，禽白血病病毒不同毒株和不同亞群之間交叉重組時有發生，一些禽白血病病毒毒株的致瘤特性也發生了不同變化。最近湖北某蛋雞場發生的一例以髓細胞瘤為主的禽白血病病例，通過病原檢測和病毒分離鑒定，確診為由A亞群禽白血病病毒引起的髓細胞瘤，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料 病雞來源于湖北某蛋雞養殖場，270日齡的京粉蛋雞。無菌采集典型病變的肝組織-80 ℃凍存，備用。

1.2 試劑 rTaq酶、dNTP 等PCR相關試劑為寶生物工程(大連)有限公司產品。Multi-PCR 檢測引物參照文獻[2-3]及已經發表的ALV-A、ALV-B、ALV-J相關基因序列設計，用于ALV-J復檢的引物H5/H7，參照文獻[6]設計，均由武漢擎科創新生物技術公司合成(見表1)。肝組織DNA提取試劑盒為上海捷瑞生物工程有限公司產品。DF-1細胞由本實驗室凍存，0.25%胰酶、FBS為HyClone產品，DMEM為Gbico產品，抗ALV-J的單抗JE9由揚州大學秦愛建教授惠贈，抗ALV-A的單抗AF3由本實驗室自制，FITC-羊抗鼠IgG，購自武漢三鷹生物科技有限公司。

表1 用于病原檢測的Multi-PCR引物

1.3 病原的Multi-PCR檢測 取病雞病變肝組織約50 mg提取DNA，方法按照試劑盒說明書進行。Multi-PCR檢測ALV-A/B/J的Multi-PCR采用25 μL反應體系：10×Buffer(Mg2+Free)2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，dNTP (2.5 mmol/L each) 2 μL，ALV-A/B/JF(10 μmol/L)2 μL，ALV-AR(10 μmol/L)0.8 μL，ALV-BR(10 μmol/L)1 μL，ALV-JR(10 μmol/L)1 μL，rTaq(5 U/μL) 0.25 μL，滅菌去離子水13.95 μL。循環條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃ 10 min。將制好的凝膠板放入電泳槽中，分別按順序加入5 μL Marker，1 μL的Loading Buffer和5 μL的待檢樣品混合液，在電壓95 V、電流90 mA條件下，30 min后放入凝膠成像系統中觀察。

1.4 病毒的分離與鑒定 取病變肝組織，按體積比1∶5加入PBS(pH值 7.2)充分研磨，凍融3次，10 000 r/min離心10 min，取上清液經濾菌器過濾除菌即為病毒懸液。取覆蓋面積約80%的DF-1細胞，棄去培養基，用PBS(pH值 7.2)洗1次，加入病毒懸液，37 ℃感作2 h，加入含1% FBS 的DMEM，培養至細胞長滿。

1.5 間接免疫熒光試驗(IFA) 將細胞盲傳入24孔板，用含1% FBS 的DMEM營養液培養1周，待細胞長滿孔底，棄上清液，再用PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定1 h，0.5% Triton X-100透膜10 min，10% FBS封閉1 h，取3孔細胞分別加ALV-A的單抗AF3和ALV-J的單抗JE9，同時設不接毒的DF1細胞作為陰性對照組，4 ℃條件下孵育過夜，PBS洗滌后，每孔分別滴加1∶200稀釋的FITC-羊抗鼠IgG，37 ℃作用1 h后，再用PBS洗滌3次，加1滴體積分數50%甘油覆蓋細胞，熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 送檢病雞的病理變化 剖檢病雞眼觀可見肝、腎、脾腫大，肝臟表面有大小不等的灰白色結節，鏡檢肝組織可見大量的髓細胞樣瘤細胞增生，肝細胞變性、壞死甚至消失(見封二彩版圖1) 。

2.2 Multi-PCR檢測結果 以病雞基因組DNA 為模板，擴增出與ALV-A相對應的715 bp左右的核酸條帶, 未擴增出與ALV-B(515 bp)和ALV-J相對應的核酸條帶(422 bp)(圖2)。

圖2 病雞PCR檢測結果

M:DNA Ladder DL-2 000; 1:Multi-PCR陽性對照；2：陰性對照； 3：病雞肝組織DNA

2.3 免疫熒光反應 以ALV-A單抗AF3為一抗的病毒接毒DF-1細胞出現明顯的亮綠熒光，以抗ALV-J的單抗JE9為一抗的接毒DF-1細胞及未接病毒液的細胞均無熒光(見封二彩版圖3)。

3 討論

臨床上，禽白血病病例由于感染的毒株或者不同，往往呈現的病理特征也不一樣。20 世紀 60 年代，世界范圍內雞群中自然發生的淋巴細胞白血病主要由 A、B亞群病毒引起[4]，其瘤細胞以原淋巴細胞為主，而且B亞群的發病率通常低于A亞群病毒的發病率。由C、D亞群病毒自然感染引起的腫瘤比較少見。20世紀的70-80年代由于歐美國家對禽白血病病毒實施有力的凈化措施，幾乎所有大型種雞場已將經典的外源性 ALV-A, B, C, D 感染基本凈化[5]。20世紀90年代以來新出現的J亞群禽白血病病毒親嗜靶細胞發生了變化，不再是腔上囊B淋巴細胞，而是骨髓干細胞、血管內皮細胞以及其他細胞，以J亞群禽白血病病毒引起禽的髓細胞瘤病和血管瘤在雞群中最為普遍。自1999年我國雞群首次發現J亞群禽白血病以來，全國各地報道的ALV-J病例不斷增多，并且呈現出宿主范圍不斷擴大化和腫瘤類型多樣化的趨勢,期間也有其他亞群的禽白血病病例發生。

本研究從一例以雞髓細胞瘤為主的禽白血病自然病例中分離到1株A亞群禽白血病病毒。這是在自然病例中首次觀察到A亞群禽白血病病毒引起蛋雞髓細胞瘤，使得禽白血病病毒亞群的致瘤特性變得更為復雜。有研究資料說明，不同毒株所致腫瘤的類型受病毒如來源和劑量以及宿主因素如年齡、基因型和性別等有關，還與外在條件的變化等有關[6]。也有可能禽白血病病毒不同亞群毒株之間也會發生交叉重組，導致病毒發生變異，誘發不同于以往的腫瘤類型。這種現象增加了雞群診斷和凈化禽白血病的難度，需要采取更加嚴格的措施，對雞群定期的、連續的抗體監測，淘汰陽性雞，達到種雞群凈化的目的。