單味中藥水提物對雞源耐藥性E.coli地方株的體外抑菌活性研究

李蘊玉， 李佩國， 張召興， 閆艷娟， 賈青輝， 常超越， 張香齋

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室， 河北 秦皇島 066604)

雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(APEC)引起不同日齡的雞發生氣囊炎、肝周炎、心包炎、急性敗血癥等多種癥狀的總稱。大腸桿菌是重要的條件致病菌，具有較多的血清型，不同的地區流行的血清型也不一樣。由于抗生素在養雞生產中的不合理使用，導致了大腸桿菌產生了很強的耐藥性，同時也造成了藥物殘留，嚴重危害著人類的健康。

中藥不僅對雞致病性大腸桿菌具有直接或者間接的殺滅作用，清除致病性大腸桿菌在雞體內產生的內毒素，還可以消除致病性大腸桿菌耐藥質粒，降低耐藥性[1]，并通過多個途徑調整機體的免疫機能，從而增強機體的抵抗力，具有不易產生耐藥性、低殘留等優點[2]。有關中藥防治雞大腸桿菌病的相關報道較多，但中藥對耐藥性大腸桿菌的抑菌活性以及防治效果的報道較少。為此，本試驗采用24種中藥水提物對河北地區分離的雞源耐藥性E.coli地方流行株進行體外抑菌活性試驗，篩選出敏感的中藥，為進一步研究抗耐藥性E.coli復方中藥制劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌標準質控菌株ATCC25922、河北地區雞源耐藥性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)，由河北省預防獸醫學重點實驗室保存。

1.2 試劑及儀器 五味子、黃連、金銀花、訶子等24種中藥(購自秦皇島民樂醫藥有限公司)；普通營養培養基、營養肉湯均(購自北京奧博星生物技術有限責任公司)；1%紅四氮唑、96孔細菌培養板(購自美國Corning公司)；隔水式恒溫培養箱(由上海一恒科技儀器有限公司生產)；高速中藥粉碎機(由青州市精誠醫藥裝備制造有限公司生產)；常規的試劑與儀器由本實驗提供。

1.3 菌液的計數 參考文獻報道的方法[6]，取出-80 ℃保存大腸桿菌標準質控菌ATCC25922、河北地區雞源耐藥性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)菌種進行復蘇，將復蘇的菌種培養至對數生長期，利用平板菌落計數法進行菌落計數。

1.4 中藥水提物的制備 用水提法制備中藥水提物，取各單味中藥100 g，粉碎后稱重，加入8～10倍蒸餾水浸泡1 h，煮開后慢火煮20 min左右，12層紗布過濾，用同樣方法再煮1次，過濾，合并2次煮的藥液進行濃縮，使其濃度為1 g/mL，離心后調整pH值為7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌,4 ℃保存備用。

1.5 單味中藥水提物體外抑菌圈直徑的測定 采用平板瓊脂打孔法方法，進行檢測單味中藥水提物體外抑菌圈直徑的大小，判定標準：15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏；10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏;10 mm以下為低敏[3-4]。

1.6 單味中藥水提物最小抑菌濃度(MIC)的測定 參照文獻報道的改良微量二倍稀釋法測定單味中藥的MIC[5]。在96孔細菌培養板第1～11孔每孔加入100 μL營養肉湯，第1孔加入100 μL中藥水提物藥液(1g/mL)，倍比稀釋到第9孔后棄100 μL，第10孔陰性對照孔，第11孔陽性對照孔，除第10孔外，每孔加10 μL菌液(108CFU/mL)，37 ℃培養24 h后，接種于普通培養基上，無菌生長的稀釋梯度為該藥的MIC。

2 結果

2.1 單味中藥水提物體外抑菌圈直徑測定結果 由表1可知，3株雞耐藥性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種中藥高度敏感；分離株QH15(O2)、QH16(O38)對地丁高度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對金銀花、夏枯草、連翹3種中藥中度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)對青皮中度敏感；QH17(O89)對女貞子中度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)對板藍根、白頭翁低敏；魚腥草、大黃、黃柏等9種中藥均無抑菌作用。

表1 單味中藥對雞耐藥性E.coli地方株體外抑菌試驗(mm)

-：無敏感性

2.2 單味中藥水提物MIC測定結果 由表2可知，3株雞耐藥性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種藥物的MIC在7.825～31.25 mg/mL之間；分離株QH15(O2)、QH16(O38)對地丁、青皮的MIC為31.25 mg/mL；3株雞耐藥性E.coli地方株均對蘇木、金銀花、夏枯草、連翹4種藥物的MIC在62.5～125 mg/mL之間；3株雞耐藥性E.coli地方株均對板藍根、白頭翁2種藥物的MIC在125～250 mg/mL之間。魚腥草、大黃、黃柏等9種中藥對標準菌株及3株雞耐藥性E.coli地方株均沒有效果。

表2 單味中藥對雞耐藥性E.coli地方株的MIC (mg/mL)

-：無敏感性

3 討論

在本試驗中，筆者采用瓊脂擴散法和改良微量二倍稀釋法測定了24種中藥水提物對雞源耐藥性E.coli地方流行株的體外抑菌活性，結果表明，3株雞耐藥性E.coli地方株對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種中藥的抑菌圈直徑在15～24 mm之間，MIC在7.825～31.25 mg/mL之間，均高度敏感；而分離株對QH15 (O2)、QH16(O38)對青皮的抑菌圈直徑為13 mm，中度敏感，但MIC為31.25 mg/mL，說明這兩種方法測定中藥抑菌活性具有一定的相關性，同時也存在一定的差異性，與張賽奇等[5]報道相一致。

本次試驗選取中藥可以分為清熱藥、攻下藥、收澀藥、解表藥、理氣藥等。24種中藥對河北地區的3個不同血清型的雞耐藥性大腸桿菌地方流行株體外抑菌試驗結果表明，訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參的抑菌效果明顯，其共同點在于都具有清熱燥濕、澀腸止瀉的功用。金銀花、夏枯草、連翹的抑菌效果次之，而魚腥草、大黃、黃柏等則沒有表現出抑菌效果。其結果與張立永[6]報道的通過對耐藥性大腸桿菌優勢血清型O1+O148流行株篩選出的敏感中藥存在一定的差異性，其原因可能與雞耐藥性大腸桿菌流行的血清型、中藥的生長環境及提取工藝有關。中藥水提法提取中藥有效成分過程中，由于加熱可能使抑菌的物質的活性降低或者破壞，從而影響了抑菌效果。另外中藥水提物還需要高壓蒸汽滅菌，在滅菌的過程中也可能降低抑菌活性，影響抑菌效果。本試驗為進一步研究抗耐藥性E.coli組方中藥制劑提供科學依據。