S．Heidelberg血清型特異性基因篩選及PCR檢測方法的建立與應用

翟立公 郭元新 王俊穎 王蓓蓓

(安徽科技學院，安徽 滁州 233100)

沙門氏菌(Salmonella)屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性菌，是公認的重要食源性致病菌之一[1]。近年來中國沙門氏菌在畜禽制品中檢出率高達20%，相比歐美地區形勢更為嚴峻[2-4]。雖然沙門氏菌的血清型較多，已經達到2 600多種，但污染食品并且造成食源性疾病的主要集中在腸炎沙門氏菌亞種的部分血清型當中。經研究[5-6]發現，食品中污染沙門氏菌的血清型根據地域、年份和食品種類不同而存在變化。據報道[1,7]，深圳地區雞肉中德比沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌(SH)檢出率較高，分別達到37.9%和20.7%；廣西地區水產品中海德爾堡沙門氏菌(SH)檢出率為1.35%。因此，針對沙門氏菌優勢血清型的檢測具有更重要的意義。

針對沙門氏菌血清型的檢測，目前主要采用傳統培養的方法(GB/T 4789.4—2016)，包括增菌培養、選擇性增菌培養、顯示培養、生化鑒定和血清型分型，需經過7 d左右才能獲得檢測報告，很難滿足現今社會的需要，如果血清的特異性不強或凝集反應較為遲緩，將會對分型造成極大的影響[8]。利用分子檢測技術(PCR)一般能在1～2 d內獲得結果，而且具有操作過程簡單、成本低、檢測結果容易判斷等優勢[9-10]。對于食源性致病菌的分子檢測技術來說目的靶點的特異性就成為檢測效果的核心問題。Collette Fitzgerald等[11]利用沙門氏菌O抗原合成rfb基因簇的各基因為靶點，建立了沙門氏菌血清群和甲型副傷寒沙門氏菌的PCR的檢測技術，經驗證準確率達到94.3%。由于沙門氏菌的抗原結構呈現多樣性，以此作為靶點對血清型的鑒定需要設計多對引物或多個PCR程序，將造成引物之間的干擾，影響整個體系的檢測靈敏度。有研究[12]報道可以通過微生物基因組信息及比較基因組方法篩選目的菌株的特異性基因作為檢測靶點。該種方法獲得靶基因較為準確，而且在沙門氏菌其他血清型的檢測過程中已經被應用。Yin Ngan等[13]利用該方法獲得了甲型副傷寒沙門氏菌的血清型特異性基因，并以此為靶點設計多重PCR檢測體系。隨著生物信息學的不斷發展，美國國立生物技術信息中心(NCBI)公布的沙門氏菌不同血清型的全基因組序列越來越多，更有利于沙門氏菌血清型特異性基因的篩選。

沙門氏菌是一類常見的食源性致病菌，隨著近年來對沙門氏菌污染狀況和血清型調查[3-4]發現，沙門氏菌污染事件大多均是一個或幾個血清型的污染爆發為主，其中SH為禽蛋肉奶制品的優勢血清型，而且該血清型的分子檢測靶點尚未被報道。本研究擬以S．Heidelberg(SH)為研究對象，利用GenBank數據庫中的SH菌株基因組信息及BLAST系統，篩選SH血清型特異性基因，并以此為檢測靶點建立SH檢測的PCR體系。為SH在食品中的快速檢測和疫情爆發的追溯提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

營養肉湯、營養瓊脂培養基等：北京陸橋技術股份有限公司；

Genview細菌基因組DNA提取試劑盒(GV-B-DNA-50)：廣州鼎國生物技術有限公司；

DNA標準分子量DS2000、Taq DNA聚合酶和2×Taq Master：廣州東盛生物科技有限公司；

引物：上海生工生物工程有限公司；

牛奶及其制品：市售；

PCR擴增儀：Life Touch型，杭州博日科技有限公司；

數碼凝膠成像分析儀：JS-1075型，上海培清科技有限公司；

二級生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X型，濟南鑫貝西生物技術有限公司；

本試驗共涉及55株菌株(包括44株不同血清型的沙門氏菌和11株非沙門氏菌)：菌株來源及數量見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 特異性基因篩選 從NCBI(National Center for Biotechnology Information)獲取SH血清型SL476菌株(NC_011083.1)的全基因組序列數據。對SH的每個基因編碼序列進行BLASTN核酸序列對比，與沙門氏菌目的血清型不同菌株的同源性完全一致，并且在其他生物中不具有同源性的基因編碼序列為SH的準特異性基因。基因BLASTN比對過程中，當Query cover(覆蓋率)值為100%，同時E值趨近于0(E值<10-200)時，作為SH的血清型準特異性基因。

1.2.2 DNA提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)說明書操作和熱裂解法[14]提取微生物基因組DNA，并將獲取的基因組DNA置于-20 ℃ 冰箱保存備用。

1.2.3 SH血清型特異性引物設計及驗證 以獲得SH的準特異性基因作為模板，設計引物(Oligo 6.0和Primer 5.0等軟件)。要求引物自身無發夾結構，引物之間不形成二聚體結構，引物擴增的目的產物長度在1 000 bp以下，上下游引物的退回溫度接近且為60 ℃左右，BLASTN驗證所選引物的特異性，作為SH血清型的特異性引物。

PCR反應體系(25 μL)：2×Taq Master 12.5 μL、上下游引物(10-5mol)各1 μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL、模板(表1中55株菌株)1 μL、ddH2O 9 μL；

PCR反應程序：95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環； 72 ℃后延伸10 min。

1.2.4 SH血清型特異性引物靈敏度評價 提取SH的基因組DNA測定濃度，并進行10倍梯度稀釋，達到10-8的稀釋度。每個稀釋度取1 μL作為模板，以上述引物進行PCR擴增，驗證各個引物的靈敏度。

1.2.5 建立SH血清型PCR檢測體系 將獲得特異性和靈敏度均較好的SH血清型特異性引物與沙門氏菌屬特異性引物139-141共同建立SH血清型PCR檢測體系(優化過程略)。最終確定PCR的反應體系為：2×Taq Master 12.5 μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL、模板3 μL、ddH2O 2.5 μL、引物139-141(10-5mol)各1.5 μL和引物pHAm8 (10-5mol)各1.5 μL。優化后的PCR反應條件：94 ℃ 預變性10 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環； 72 ℃后延伸10 min。PCR產物通過2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.6 特異性和菌落靈敏度評價 提取沙門菌屬內各血清型菌株和常見非沙門菌-食源性致病菌的全基因組DNA，并以此為模板，使用SH血清型檢測PCR體系進行擴增，驗證其特異性。

將SH接種到LB液體培養基上，37 ℃培養12 h，平板菌落計數獲得菌液的初始濃度。通過無菌的生理鹽水進行10倍梯度稀釋，各稀釋度取1 mL，利用熱裂解法提取基因組DNA作為模板，驗證PCR檢測體系的靈敏度。

1.2.7 抗干擾性評價 選取與沙門菌同源性較高的屬外大腸桿菌ATCC35150及SH血清型同一血清群的鼠傷寒沙門菌CMCC51005作為檢測體系的干擾菌。過夜培養，通過平板菌落計數法獲得2種菌液的初始濃度，濃度梯度稀釋到N×105～N×101CFU/mL，并分別與濃度為N×102CFU/mL 的SH菌共同接種于LB培養基中，37 ℃培養10 h，提取基因組DNA進行PCR驗證，電泳判斷PCR檢測體系抗雜菌的干擾能力。

1.2.8 人工污染樣品檢測 過夜培養SH(CICC21487)，采用平板菌落計數法獲得菌液的初始濃度，生理鹽水進行10倍梯度稀釋，將不同稀釋度的菌液，各取1 mL轉接入24 mL 牛奶樣品(市售，無菌)，混勻，再轉入225 mL LB液體培養基中，37 ℃增菌分別培養6，8，10 h，分別提取基因組DNA，進行檢測。

表1 試驗菌株及引物特異性檢測結果?

? *1實驗室分離的S. Heidelberg ;*2實驗室分離的非S. Heidelberg。

2 結果與分析

2.1 SH血清型特異性基因篩選及相關引物靈敏度評價

通過BLASTN系統對SH的全基因組序列數據進行分析，并通過PCR驗證(表1)，最終鑒定4個SH血清型特異性基因(表2)。通過分析以上基因的功能注釋，發現4 個基因編碼的蛋白均具有生物學活性，無編碼假設蛋白。

以上述4個基因為模板分別設計SH血清型DNA檢測引物，引物序列見表2。提取過夜培養的SH(CICC21487)基因組DNA，無菌水梯度稀釋，各稀釋度取1 μL，相同條件下進行PCR擴增，比較不同引物的模板靈敏度。圖1表明，pHAm1和pHAm9引物的DNA靈敏度為14 pg/μL，pHAm3引物的為1.4 pg/μL；當模板濃度達到140 fg/μL 時，只有pHAm8引物能獲得目的條帶。因此，選取pHAm8引物作為SH血清型PCR檢測特異性引物。

表2 引物序列及PCR產物大小

M. DS2000(100，250，500，750，1 000，2 000 bp) 1. 14 ng/μL 2. 1.4 ng/μL 3. 140.0 pg/μL 4. 14.0 pg/μL 5. 1.4 pg/μL 6. 140.0 fg/μL 7. 14.0 fg/μL 8. 1.4 fg/μL

圖1 PCR檢測海德爾堡沙門氏菌(DNA)靈敏度

Figure 1 Detection sensitivity (DNA) of PCR forS. Heidelberg

2.2 SH血清型PCR檢測特異性評價

將實驗室保存的44株沙門菌和11株非沙門菌提取全基因組DNA進行PCR檢測，對該體系的特異性進行驗證，結果見圖2和表1。結果表明，當檢測樣品中有SH菌時，能同時獲得2條擴增條帶(284，350 bp)；當檢測非SH的沙門菌時，只能得到284 bp的擴增條帶；當檢測非沙門氏菌時，無任何PCR擴增條帶產生。該結果與Park等[15]報道的結果一致，對SH均能表現較好的特異性，但檢測體系中涉及的引物及檢測靶點均不一樣。

M. DS2000(100，250，500，750，1 000，2 000 bp) 1～34.S. Heidelberg、S. Choleraesuis、S. Typhimurium、S. Typhi、S. Enteritidis、S. Paratyphi A、S. Paratyphi B、S. Paratyphi C、S. Dublin、S. Thompson、S. Anatum、S.Senftenberg、S. Arizonae、S. Potsdam、S. Aberdeen、S. Bovismorbificans、S. Meleagridis、S. London、S. Braenderup、S. Bredeney、S. Saintpaul、S. Heidelberg、S. Kentucky、S. Blockley、S. Bonariensis、S. Wandsworth、S. Adelaide、S. Dakar、S. Eastboure、S. Miami、S. Agona、S. Bazenheid、S. Montevideo、S. Jerusalem、S. Bonn

圖2 雙重PCR檢測特異性

Figure 2 Specificity of double PCR for detectingSalmonellastrains

2.3 SH血清型PCR檢測靈敏度評價

將過夜培養的SH菌液，用無菌水進行梯度稀釋得到濃度為6.1×106～61 CFU/mL的稀釋液。各梯度取1 mL菌懸液，提取基因組DNA，在最優PCR體系下進行擴增(圖3)。結果表明，該PCR反應體系中pHAm8引物對SH的檢測為6.1×102CFU/mL，139-141引物對沙門菌的檢測限能達到61 CFU/mL。

M. DS2000(100，250，500，750，1 000，2 000 bp) 1～6. SH菌液濃度分別為6.1×106，6.1×105，6.1×104，6.1×103，6.1×102，6.1×101CFU/mL

圖3 雙重PCR檢測體系活菌靈敏度

Figure 3 Sensitivity of double PCR for detection of viable cells

2.4 SH血清型PCR檢測抗干擾能力評價

為檢測該雙重PCR反應體系在干擾菌存在時的擴增效果，取不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌(CMCC51005)和大腸桿菌(ATCC35150)作為干擾菌與SH共同培養，再提取基因組DNA進行PCR驗證。將鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌分別稀釋為3.2×105～3.2×101CFU/mL和6.9×105～6.9×101CFU/mL，每個稀釋度中分別接入濃度為7.4×102CFU/mL 的SH菌懸液，37 ℃培養8 h，提取混合菌液的DNA進行PCR檢測，結果見圖4。當鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌的濃度在所取菌懸液濃度范圍時，該反應體系的雙重PCR結果的2對引物(139-141和pHAm8)均可獲得清晰的目的條帶產物，不會影響最終檢測結果的判斷。表明該雙重PCR檢測體系針對于大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌具有一定的抗干擾能力。

1～5. 鼠傷寒沙門氏菌菌液濃度分別為3.2×105，3.2×104，3.2×103，3.2×102，32 CFU/mL 6～10. 大腸桿菌菌液濃度分別為6.9×105，6.9×104，6.9×103，6.9×102，69 CFU/mL

圖4 雙重PCR抗干擾性評價

Figure 4 Anti-interfence of double PCR for detection ofS. Heidelberg

2.5 SH血清型PCR檢測人工污染評價

將過夜培養的SH菌懸液，梯度稀釋為1.52×104～1.52 CFU/mL 等濃度，每個稀釋度各取1 mL接入市售牛奶(24 mL)，再轉接到225 mL TSB液體培養基中分別進行6，8，10，12 h的增菌培養，試劑盒法提取基因組DNA，PCR擴增進行檢測，結果見圖5。當擴大培養6 h時，初始含菌量為1.52×102CFU/mL的牛奶樣品中能夠檢測出SH；牛奶樣品初始SH污染量為1.52 CFU/mL，需增加培養8 h以上才能獲得陽性檢測結果。該反應體系在牛奶樣品中的檢測限略低于Kim等[16]針對于沙門氏菌多個血清型建立的多重RT-PCR檢測體系在食品樣品中的檢測限。

1～5. SH菌液濃度分別為1.52×104，1.52×103，1.52×102，15.2，1.52 CFU/mL

圖5 人工污染牛奶樣品SH雙重PCR檢測結果

Figure 5 Detection results of artificially contaminated milk ofS. Heidelberg

3 結論

本研究利用分子信息學和比較基因組技術，篩選到了4個SH的血清型特異性基因，分別是SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3259和SeHA_C3258。同時SeHA_C3258作為SH血清型特異性基因設計引物pHAm8(擴增350 bp)和沙門氏菌屬特異性引物139-141(284 bp)共同建立SH檢測的雙重PCR檢測方法。通過對該檢測方法的特異性、靈敏度、抗干擾能力和人工污染評價，表明該方法具有較高的靈敏度和特異性，相較于傳統培養方法能夠節省大量的成本和時間，具有較好的應用價值。但隨著現代食品工業的快速發展，對微生物檢測的時效性和現場檢測的要求越來越高，利用篩選的靶基因建立更快速的核酸恒溫擴增檢測技術將是未來的發展方向。