亞麻籽粕木酚素的純化及對DNA氧化損傷保護

張永超 張 利 張云松 姜媛媛 吳一超

(四川農業大學理學院，四川 雅安 625014)

亞麻籽是亞麻科(Linaceae)亞麻屬(LinumL.)一年生草本植物亞麻(LinumusitatissimumL.)的成熟種子，其成分主要包括油脂、蛋白質、礦物質、亞麻籽膠、維生素、木酚素等[1-2]。木酚素是一類由雙分子苯丙素合成的天然酚類化合物，具有C6—C4—C6的基本骨架(圖1)，廣泛分布在多種植物中，其中亞麻籽中含量最高[3-4]。作為植物雌激素及良好的天然抗氧化劑，木酚素具有多方面的藥理活性,包括抗腫瘤[5]、預防心血管疾病[6]、預防骨質疏松和糖尿病[7-8]等。傳統亞麻籽的應用僅局限于榨油，榨油后的副產物亞麻籽餅粕除少量用于動物飼料外，一般作為肥料或者廢物處理，造成了資源的極大浪費[9-10]。因此，以亞麻籽餅粕為原料建立快速分離制備木酚素的方法對提高資源的有效利用率具有重要意義。

傳統分離純化亞麻木酚素的方法多采用C18填充柱色譜、制備型C18色譜柱和硅膠層析柱色譜。上述方法雖樣品處理量大，但操作較為繁瑣、分離效率較低[11]。Andreas等[12]采用高速逆流色譜對亞麻木酚素提取物進行純化，產品純度達到90%以上，該方法雖消除了不可逆吸附，但在選擇兩相溶劑系統時由于缺乏理論指導而較為困難，且往往需要在分離之前采用吸附樹脂進行初步分離(富集)。張文斌等[13]采用X-5型大孔吸附樹脂分離純化亞麻木酚素，產品純度達到了65.7%。大孔吸附樹脂雖然具有吸附性能好、效率高、解吸方便等優點，但是多適用于樣品的粗分離，如需含量更高的產品應結合其它分離方法[14]。大孔吸附樹脂或硅膠柱層析與半制備高效液相色譜法(HPLC)聯用具有分離速度快、產品純度和回收率高等優點，已被廣泛應用于植物有效成分的分離制備中[15]，然而目前未見文獻報道采用大孔吸附樹脂與半制備高效液相色譜聯用純化亞麻木酚素。

機體受到輻射或免疫力低下時，體內的自由基會大量產生，如短時間難以消除將會氧化體內大分子進而損傷組織或器官，如：自由基引起脂質過氧化、誘導DNA損傷等[16-18]。DNA的持續損傷，可能會引起DNA復制或翻譯錯誤，從而導致點突變或染色體重排及經由各種信號途徑引起應激反應，引起細胞衰老，引發老年病[19]。木酚素作為植物雌激素及良好的天然抗氧化劑，具有一定消除過氧化的能力[5-8]。因此，本研究擬采用大孔吸附樹脂與半制備高效液相色譜聯用技術純化亞麻木酚素，并探究其對質粒DNA氧化損傷的保護作用，旨在為亞麻籽餅粕的高效開發利用提供一種新思路。

圖1 木酚素母體結構及亞麻籽中主要的木酚素

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽粕：菏澤中禾健元生物科技有限公司；

亞麻木酚素標準品：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；

乙腈、磷酸：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

NaOH、HCl、甲醇、乙醇、乙酸乙酯：分析純，成都市科隆化學品有限公司；

pH 5.5～9.0精密試紙：上海三愛思試劑有限公司；

D101型大孔吸附樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；

質粒DNA：由四川農業大學生命科學學院提供；

瓊脂糖、6×DNA Loading Buffer、λ DNA/Hind III Marker：寶生物工程(大連)有限公司；

高效液相色譜系統：LC-20A型，包括SPD-20A紫外—可見光檢測器、SIL-20A自動進樣器、2LC-10ADvp泵，日本島津公司；

半制備液相色譜系統：D-P6100型，配有2臺NP7000輸液泵、NU3000C紫外檢測器，江蘇漢邦科技有限公司；

旋轉蒸發器：RE52CS-1型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機：LGJ-12型，北京松源華興科技發展有限公司；

恒溫水浴鍋：B-260型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外可見分光光度計：A390型，上海翱藝儀器有限公司；

循環水式多用真空泵：SHZ-D(III)型，鞏義市英峪高科儀器廠；

高速冷凍離心機：HC-3018R型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

電泳儀及凝膠成像系統：Bio-Rad型，美國伯樂公司；

電子分析天平：BSA124S型，北京賽多利斯儀器系統有限公司；

玻璃層析柱：2.5 cm×40 cm，上海華美實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 亞麻木酚素HPLC檢測方法的建立 精密稱取適量亞麻木酚素標準品，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成0.144 mg/mL 的標準品儲備液，于4 ℃保存備用。通過對標準品儲備液全波長掃描，確定HPLC分析波長。選用Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃?？疾斓榷认疵?0～30 min，20% A∶80% B)和梯度洗脫(0～10 min，15%～20% A；10～15 min，20%～80% A)2種方式對亞麻木酚素的分離效果，從而建立亞麻木酚素HPLC檢測方法。

1.2.2 亞麻籽粕中木酚素的提取 稱取亞麻籽粕50 g，按1∶10 (g/mL)的料液比加入70%甲醇溶液浸泡3 h，回流提取1 h，過濾，濾渣二次提取，合并濾液。濾液加入4 mol/L的NaOH溶液至最終堿濃度為0.1 mol/L，堿解30 min，加入10% HCl調pH至5.0～5.5，靜置30 min，離心(4 500 r/min，10 min)，濃縮濾液至原體積的1/20。濃縮液用乙酸乙酯萃取3次，得亞麻木酚素萃取液，備用。

1.2.3 大孔吸附樹脂與半制備HPLC聯用純化亞麻木酚素

亞麻木酚素萃取液經D101型大孔吸附樹脂洗脫(樹脂的預處理參考文獻[20～21])。先用蒸餾水以1 mL/min 的速率除去多糖、蛋白質等雜質，然后在相同條件下依次采用10%，20%，30%，40%的乙醇進行洗脫，每個梯度1.5個柱體積。收集洗脫液，進行檢測后合并目標組分洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到亞麻木酚素純化物I，4 ℃保存備用。

稱取淡黃色的亞麻木酚素純化物I適量，70%甲醇溶液溶解稀釋至42 mg/mL。以Megres C18(30 mm×250 mm，10 μm)為色譜柱，乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動相，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，通過改變流動相的組成(15%～25% A∶85%～75% B)、流速(35，40，45 mL/min)、上樣量(采用體積超載的方式，固定樣品溶液的濃度為42 mg/mL，依次進樣1，2，3 mL)確定半制備HPLC分離亞麻木酚素的最優條件。在該條件下收集主色譜峰洗脫液，冷凍干燥，得到亞麻木酚素純化物II。

1.2.4 亞麻木酚素純化物II對質粒DNA氧化損傷的保護作用 采用瓊脂糖凝膠電泳法研究亞麻木酚素純化物II對質粒DNA氧化損傷的保護作用，參照張溢等[22]方法并作適當修改。

對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷的保護作用：精密量取2 μL質粒DNA，加入4 μL不同濃度的亞麻木酚素水溶液(0.40，0.35，0.30，0.25，0.20，0.15，0.10，0.05，0.00 μg/μL)，混勻，迅速加入10%的H2O22 μL，用滅菌水補足反應體系至10 μL。37 ℃水浴20 min后，90 V電壓下瓊脂糖凝膠電泳30 min，結束后在凝膠成像系統下觀察電泳結果。

對光解條件下H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷的保護作用(H2O2在光解作用下可以產生羥基自由基)[23]：將上述方法中亞麻木酚素水溶液的濃度變為0.07，0.09，0.12，0.15 μg/μL，37 ℃水浴20 min變為水浴10 min后紫外光照射10 min，其它條件不變。

2 結果與分析

2.1 亞麻木酚素HPLC檢測方法的建立

通過對標準品儲備液全波長掃描，確定亞麻木酚素在280.5 nm處具有最大吸收波長(圖2)。因此，選擇280 nm作為檢測波長。結果表明：采用梯度洗脫，0～10 min，15%～20% A；10～15 min，20%～80% A時，亞麻木酚素可以在15 min內獲得良好的分離度。在此條件下，亞麻木酚素標準品的色譜圖見圖3。

2.2 半制備HPLC分離亞麻木酚素條件的優化

2.2.1 流動相的組成 在上樣量1 mL，流速35 mL/min的條件下，考察了流動相的組成對亞麻木酚素分離效果的影響，結果見圖4。由圖4可知，采用等度洗脫時分離度較低，且若增大流動相中B的比例可以使分離時間明顯縮短，但與此同時亞麻木酚素與其附近雜質峰之間的分離度也逐漸下降。采用梯度洗脫時，5 min以后再將乙腈的比例由20%增至25%時分離度(1.67)及分離時間(10.136 min)均比較理想。故最優洗脫條件為梯度洗脫，0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～15 min，25% A。

圖2 亞麻木酚素標準品的紫外光譜圖

圖3 亞麻木酚素標準品的色譜圖

圖4 流動相的組成對分離效果的影響

2.2.2 流動相的流速 在上樣量1 mL，最優洗脫條件時，考察了流動相流速對分離效果的影響，結果見圖5。圖5(a)、(b)的流速分別為40，45 mL/min。由圖5可知，隨著流速的增加，分離時間逐漸縮短，但亞麻木酚素與其附近雜質峰之間的分離度也逐漸下降。比較圖5(a)、(b)與圖4(d)，發現當流速為35 mL/min時，亞麻木酚素的分離度(1.67)及分離時間(10.136 min)均比較理想，故選擇35 mL/min為最佳流速。

2.2.3 上樣量 在流速35 mL/min，最優洗脫條件時，考察了上樣量對分離效果的影響，結果見圖6。圖6(a)、(b)的上樣量分別為84，126 mg。由圖6可知，隨著上樣量的增加，相鄰2組分間的分離度減小，當上樣量到達一定量時，相鄰組分無法實現分離。上樣量為126 mg時，亞麻木酚素與其附近的雜質峰分離度較低，考慮產品的純度及分離效率，選擇上樣量為84 mg。

綜上，使用半制備HPLC分離亞麻木酚素的最佳條件為：Megres C18(30 mm×250 mm，10 μm)色譜柱，流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)進行梯度洗脫0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～16 min，25% A，檢測波長280 nm，進樣量2 mL，流速35 mL/min，柱溫30 ℃。在該條件下，收集色譜圖中標1的組分[圖6(a)]，冷凍干燥獲得亞麻木酚素純化物II。

2.3 純度分析

采用已建立的亞麻木酚素含量檢測HPLC方法，繪制亞麻木酚素的標準曲線Y=4.369 1×106X-1.187 2×102，R2=0.999 99，線性范圍5.76 ～144.00 μg。亞麻木酚素標準品、萃取液、純化物I、純化物II的色譜圖見圖7。圖7中標1的色譜峰峰保留時間一致，均在10.5 min。定量分析結果表明：亞麻木酚素萃取液、純化物I、純化物II的純度依次為18%，60%，98%。

大孔吸附樹脂是一類新型高分子材料，具有吸附性能好、效率高、解吸方便等優點，在分離純化中草藥活性成分方面顯示出極大的優越性，但是所得的樣品純度往往不高，多適用于粗分離[14]。半制備高效液相色譜分離純化具有速度快、產品純度和回收率高等優點，目前已被廣泛應用于植物有效成分的分離制備中，但是成本較高且分離量有限[15]。若使樣品在進行半制備高效液相色譜純化之前先得到粗分離(富集)，則可以取得更好的純化效果。因此，本試驗通過大孔吸附樹脂與半制備高效液相色譜聯用技術純化亞麻木酚素，產品純度可達到98%，與楊雪艷(純度59.30%)[20]、楊宏志(純度66.71%)等[21]比較具有較大優勢。

2.4 亞麻木酚素純化物II對質粒DNA氧化損傷的保護作用

亞麻木酚素對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷的保護作用見圖8(a)。質粒DNA在自然狀態下為超螺旋結構[24]，電泳結果顯示為一條譜帶(泳道10)。在誘導處理過程中部分DNA由超螺旋結構變為開環結構，呈現出2條譜帶，如圖8(a)泳道8和泳道9顯示。此外，電泳條帶的亮度反映了DNA含量的多少，條帶越亮說明DNA含量越高；反之，含量越低[25-26]。因此，由圖8(a)可知：當亞麻木酚素濃度為0.05 μg/μL時，對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷無保護作用；當濃度在0.1～0.4 μg/μL時，亞麻木酚素對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷具有顯著保護作用(與泳道10對比)。

圖5 流動相的流速對分離效果的影響

圖6 上樣量對分離效果的影響

圖7 HPLC色譜圖

泳道1～9. DNA+H2O2+不同濃度亞麻木酚素(0.40，0.35，0.30，0.25，0.20，0.15，0.10，0.05，0.00 μg/μL) 泳道10. DNA 泳道11. λDNA/Hind III Marker

(a) H2O2誘導質粒DNA損傷

泳道1、3、5、7. DNA+H2O2+不同濃度亞麻木酚素(0.07，0.09，0.12，0.15 μg/μL) 泳道2、4、6. DNA+H2O2+UV+不同濃度亞麻木酚素(0.07，0.09，0.12 μg/μL) 泳道8. DNA 泳道9. λDNA/Hind III Marker

(b) H2O2光解反應誘導質粒DNA損傷

圖8 不同濃度亞麻木酚素水溶液對質粒DNA損傷保護作用的電泳圖

Figure 8 Electrophoretic pattern of Plasmid DNA in the presence or absence of SDG

根據亞麻木酚素對H2O2誘導質粒DNA氧化損傷的保護作用的研究結果，進一步探討了亞麻木酚素對光解條件下H2O2誘導質粒DNA氧化損傷的保護作用，結果見圖8(b)。由圖8(b)可知，濃度在0.07 ～0.12 μg/μL時，亞麻木酚素對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷具有保護作用，但對光解條件下H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷并無顯著的保護作用。

通過研究亞麻木酚素對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷以及H2O2光解反應誘導的質粒DNA氧化損傷的保護作用，可間接說明其是否具有抗氧化能力。本研究結果表明，亞麻木酚素對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷的保護作用較H2O2光解反應誘導的質粒DNA氧化損傷的強。一方面是由于DNA在紫外光處理下更易遭到破壞[24]，另一方面可能是設置的亞麻木酚素濃度太低，未能起到保護作用或是亞麻木酚素在紫外光照射下發生了分解[27-28]，導致其喪失了原有的抗氧化能力，但需要試驗進一步驗證。

3 結論

本研究以亞麻籽粕為原料，采用回流法提取木酚素，提取液經乙酸乙酯萃取、D101型大孔吸附樹脂柱分離后，再通過半制備HPLC純化，獲得了純度為98%的亞麻木酚素。優化得到半制備HPLC純化亞麻木酚素的條件為：Megres C18(30 mm×250 mm，10 μm)為色譜柱，乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動相進行梯度洗脫0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～16 min，25% A，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，流速35 mL/min，進樣量2 mL。亞麻木酚素質量濃度>0.07 μg/μL時，對H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷具有較好的保護作用，但在測定濃度范圍內(0.07～0.12 μg/μL)亞麻木酚素對光解條件下H2O2誘導的質粒DNA氧化損傷的保護作用不顯著。本研究為亞麻籽粕中木酚素的分離純化提供了新思路。