蒸汽爆破提取牛膝多糖工藝優化及抗氧化性研究

易軍鵬王 賽李 欣楊亞皇趙鵬成朱文學

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023; 2. 河南科技大學化工與制藥學院，河南 洛陽 471023)

牛膝(AchyranthisbidentataeRadix)為莧科植物牛膝(AchyranthesbidentataBl.)的干燥根[1]。牛膝屬多年生草本，有懷牛膝和川牛膝之分。懷牛膝主要分布在河南，與懷地黃、懷菊花、懷山藥并稱為四大懷藥。懷牛膝中的主要活性物質有三萜皂苷、甾醇類(以蛻皮甾醇為主)、多糖及生物堿等。現代藥理研究表明，牛膝多糖具有免疫調節的作用[2]。因此，牛膝在食品藥品行業，特別是保健品行業備受關注。

傳統的多糖提取工藝普遍得率較低。在傳統的水提醇沉提取工藝中，優化后的牛膝多糖得率大約在5.31%[3]。加入超聲和微波輔助后，牛膝多糖得率分別提升至12.37%和11.70%[4-5]，但是這2種輔助工藝需要在提取過程中持續加入外界條件，能耗和成本較高。

蒸汽爆破(Steam Explosion Pre-treatment, SEP)是處理植物木質纖維素最常用的辦法[6-7]。它將植物原料浸潤在高溫高壓的水蒸氣中，維持幾秒至幾分鐘后瞬時(0.087 5 s)泄壓，可以有效地打破原料中植物細胞壁或者表面纖維等抗提取屏障。國內外研究[8-10]表明，蒸汽爆破可使原料溶出率增加，提取率顯著提高。該預處理技術已應用于糧食、油脂和中草藥等[11-14]行業。但未見對牛膝蒸汽爆破處理后，其活性成分及抗氧化活性變化的研究報道。本研究擬以河南產懷牛膝為原料，多糖得率為指標，優化了牛膝的蒸汽爆破處理條件，并研究了蒸汽爆破預處理對牛膝多糖清除DPPH自由基和O2-自由基能力的影響，以期為牛膝多糖活性的提高提供有力的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛膝：購于河南省洛陽市張仲景大藥房，經河南科技大學林學院林曉民教授鑒定為懷牛膝，產地焦作；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)： 上海伊卡生物技術有限公司；

無水乙醇、乙醚、丙酮、苯酚等：分析純，天津德恩化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

間歇式蒸汽爆破機：QBS-80型， 鶴壁正道生物能源有限公司；

高速冷凍離心機：DS-1型，上海生析超聲儀器有限公司；

分析天平：FA-1005型， 上海儀器有限公司；

電子掃描顯微鏡：JSM-5610LV型，日本電子株式會社；

紫外可見分光光度計：UV-2400型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

差示量熱掃描儀(含鋁坩堝)：DSCⅠ型，瑞士MEttler-Toledo公司；

傅里葉紅外變換光譜儀：TENSPOR27型，德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛膝蒸汽爆破預處理 將干燥的牛膝根塊用等梯度比例的去離子水預浸泡6 h，放入蒸汽爆破機物料倉(每次約100 g)中，通入飽和蒸汽，選取不同梯度維壓時間和蒸汽爆破壓力，在微秒內(0.087 5 s)完成釋壓，實現蒸汽爆破(預浸泡含水率、蒸汽爆破維壓時間和汽爆壓力選取詳見1.3.3 單因素試驗)。預處理后的樣品在使用前需要置于50 ℃干燥至恒重。另取一部分未經蒸汽爆破處理的干燥牛膝作為空白對照。

1.3.2 牛膝粗多糖熱回流提取 將蒸汽爆破處理和未處理的牛膝分別粉碎過篩，各取粒度為40～60目的樣品。設定水浴溫度為60 ℃、水浴時間2 h，采用l∶15 (g/mL)的料水比提取牛膝多糖，將提取液濃縮至原體積的1/4，再加入3倍體積無水乙醇4 ℃下過夜沉淀，4 500 r/min離心10 min后取沉淀，用乙醇、乙醚和丙酮各洗滌1次來除去小分子物質，沉淀用等體積水復溶，并用Sevag法除蛋白。粗多糖含量采用苯酚—硫酸法進行測定，以葡萄糖為標品，得到標準曲線方程y=0.011 3x-0.016 7 (R2=0.997)。牛膝粗多糖提取率按式(1)計算。

(1)

式中：

S——牛膝多糖得率，%；

c——多糖溶液濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

D——稀釋倍數；

m——牛膝樣品質量，g。

粗多糖的熱力學分析和紅外表征，以及抗氧化研究均選取最優蒸汽爆破工藝條件下預處理得到的牛膝多糖產品，檢測前真空冷凍干燥(冷阱溫度-40 ℃，真空度≤100 Pa，處理24 h)，得到粉末狀粗多糖制品。

1.3.3 蒸汽爆破預處理工藝優化

(1) 單因素試驗：蒸汽爆破工藝的優化選取預浸泡含水率、維壓時間和汽爆壓力3個因素，每個因素設5個水平，考察汽爆壓力為0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 MPa；維壓時間為0，30，60，90，120 s；預浸泡含水率為0%，5%，10%，15%，20%時的多糖提取率。當一個因素變化時，控制其它2個因素固定在預浸泡含水率10%，或汽爆壓力1.5 MPa，或維壓時間60 s。

(2) 響應面試驗設計：在單因素優化試驗的基礎上，確定預浸泡含水率、汽爆壓力、維壓時間3個獨立變量，以牛膝多糖提取率為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理，對牛膝蒸汽爆破工藝采用三因素三水平響應面分析法進行試驗設計，并利用Design-Expert軟件進行數據分析，優化蒸汽爆破工藝參數。單次試驗重復3次，試驗結果取平均值。

1.3.4 牛膝微觀結構的觀察 用導電膠將樣品粘到樣品臺，通過離子濺射技術對其進行噴金處理，設定加速電壓20 kV，電流15 mA，用掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.3.5 牛膝多糖熱力學分析 采用差式量熱掃描儀(DSC)進行分析。準確稱取(10±0.1) mg牛膝多糖，置鋁坩堝中并壓實密封，以密封空鋁坩堝做參比，在30 ℃下平衡1 min，再以20 ℃/min的速率升溫加熱，使機器溫度由30 ℃上升到280 ℃，氮氣流速40 mL/min，記錄各個樣品不同溫度熱處理的DSC熱相圖。

1.3.6 牛膝多糖紅外表征 對牛膝多糖進行溴化鉀壓片法制樣(樣品和溴化鉀質量比約為1∶20)，用傅里葉變換紅外分光光度計在室溫下，各樣品在波長4 000～400 cm-1內進行掃描并記錄紅外光譜圖。

1.3.7 牛膝多糖體外抗氧化活性

(1) DPPH清除自由基測定：參考孫玉林等[15]的方法做適當修改，準確配制摩爾濃度為0.1 mmol/ L 的DPPH-乙醇溶液，現配現用。多糖樣品用蒸餾水配制不同濃度的樣液，VC做陽性對照，取2 mL樣液和2 mL DPPH溶液于試管中，渦旋均勻后室溫避光放置20 min，在517 nm處測定吸光值A1，A2用無水乙醇代替DPPH溶液，A0為蒸餾水和DPPH溶液。按式(2)計算自由基清除能力。

(2)

式中：

KDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品吸光值；

A2——對照吸光值；

A0——空白吸光值。

(3)

式中：

A1——樣品吸光值；

A0——空白吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 預浸泡含水率對牛膝多糖得率的影響 由圖1可知，預浸泡含水率對牛膝多糖的得率產生影響。隨著預浸泡含水率的增加，多糖得率呈先增加后趨于平穩的趨勢。預浸泡含水率對多糖提取率的影響是由于使用的原料為干燥的牛膝，若直接進行蒸汽爆破，水分不能充分滲透物料內部。增加水的預浸泡會使物料溶脹，可在蒸汽爆破過程加快蒸汽的滲透，從而在泄壓瞬間增大機械剪切力[17]。當預浸泡含水率為10%時，牛膝已完全溶脹，再增大預浸泡水量，對多糖提取沒有明顯影響。

圖1 預浸泡含水率對牛膝多糖得率的影響

2.1.2 蒸汽壓力和維壓時間對牛膝多糖得率的影響 蒸汽爆破設備的2個參數蒸汽壓力和維壓時間決定了蒸汽爆破的反應強度，影響蒸汽爆破處理物料的結果，進而關系到牛膝多糖的得率(圖2～3)。隨著蒸汽爆破壓力的增大和維壓時間的增長，牛膝多糖得率均呈先增加后降低的趨勢。由圖2、3 可知，蒸汽爆破壓力1.5 MPa和維壓60 s時得率最高。這可能是由于隨著蒸汽爆破強度越強，越能有效地打破物料內部抗提取屏障，可加速多糖的溶出，Sui等[18]曾報道過，蒸汽爆破促使了物料內部多孔網絡的產生和放大，改變多孔性質從而改善了萃取過程；另一個原因可能是蒸汽爆破會使半纖維素降解，釋放出降解產物水溶性多糖，導致了多糖產率的增加，Sun等[19]的研究曾證實過該觀點。但當蒸汽爆破壓力繼續增加時，牛膝多糖得率會下降，推測是由于巨大的機械剪切力使糖苷鍵進一步斷裂[20]，多糖降解成為寡糖或單糖等，在提取過程中無法醇沉或被洗掉。

圖2 維壓時間對牛膝多糖得率的影響

圖3 蒸汽爆破壓力對牛膝多糖得率的影響

2.2 響應面優化提取工藝

以牛膝多糖提取率為指標，通過Box-Benhnken響應面法對蒸汽爆破處理牛膝工藝進行分析，得到多元二次回歸模型方程式：

(4)

Box-Behnken試驗因素和水平見表1，響應面設計方案及結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素和水平表

表2 響應面設計方案及結果

蒸汽爆破各因素對牛膝多糖得率影響響應面及等高線見圖4。各因素之間交互作用的強弱能夠由等高線的形狀反映，圓形說明兩因素交互作用不顯著，橢圓形則相反。從圖4可以看出，含水率與維壓時間的交互項呈現出典型的橢圓形，說明交互作用顯著。此外，沿維壓時間軸方向的等高線密度變化略高于含水率方向的變化，說明維壓時間對多糖得率的影響較大。其余兩交互因素等高線的形狀趨近于圓形，未達顯著水平。

通過模型預測，得到蒸汽爆破工藝的最優值為預浸泡含水率11%，蒸汽爆破壓力1.57 MPa，維壓時間63.14 s，在相同提取條件下，多糖得率為11.90%。為檢驗得到的結果是否準確，采用上述蒸汽爆破優化條件，考慮到多位小數不利于實際操作，蒸汽爆破工藝參數修正為：預浸泡含水率11%，蒸汽爆破壓力1.6 MPa，維壓時間63 s時，在此條件下多糖得率為11.88%，實際測量值與理論值相接近，差異不顯著。本試驗采用蒸汽爆破處理樣品，在相同提取條件下高出未經爆破處理的近2倍。這與當前倪輝等[8]、孫俊良等[9]的研究結果均一致。蒸汽爆破技術是純物理手段，從生產成本和綠色安全上考慮，是一種短時高效的方法。采用修正后的方法得到的蒸汽爆破參數準確可靠，具有一定實用價值。

圖4 各因素交互作用對牛膝多糖得率影響的三維曲面圖

變異來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型51.1195.68151.44<0.000 1**X16.4316.43171.36<0.000 1**X21.3711.3736.520.000 5**X32.7412.7473.01<0.000 1**X1X20.2110.215.520.051 1X1X32.2512.2560.00<0.000 1**X2X30.1710.174.480.072 0X214.3214.32115.16<0.000 1**X2221.08121.08562.24<0.000 1**X239.0419.04241.06<0.000 1**殘差0.2670.04失擬項0.1930.063.730.117 8不顯著凈誤差0.0740.02總誤差51.3716

2.3 蒸汽爆破對牛膝掃描電鏡表觀的影響

蒸汽爆破處理和未處理的牛膝電鏡圖見圖5。未處理牛膝表面堅硬，結構致密有序，且表面附著顆粒狀物質，這與劉傳敏[21]的研究結果相似。由圖5(b)可知，蒸汽爆破可極大地改變牛膝的微觀結構，表皮層受到嚴重破壞，纖維結合變得松弛，有很大程度的斷裂，出現較大的溝壑和空洞，推測是由于半纖維素的斷裂和降解，這一現象與許丙磊[22]的發現一致，也與王風芹等[23]報道的結果相似。從圖5(d)可以看出，由于蒸汽爆破的作用，牛膝表面顆粒狀物質明顯增多。蒸汽爆破對牛膝結構的破壞，會使多糖提取過程中，溶劑更容易滲入到牛膝內部，使提取更加完全，這與蒸汽爆破處理后，牛膝多糖得率增高的結果相一致。

圖5 蒸汽爆破處理和未處理牛膝掃描電鏡圖

Figure 5 Scanning electron micrographs of steam-explosion pretreated and untreatedAchyranthesbidentataRadix

2.4 蒸汽爆破對牛膝多糖熱穩定性的影響

經汽爆處理后的牛膝多糖(SEP)與未爆破的牛膝多糖的DSC分析見圖6和表4。2種多糖均具有2個吸熱峰(峰1和峰2)和一個放熱峰(峰3)。1號吸熱峰可能是較低溫度下，多糖的自由水和結合水的蒸發吸熱。2號吸熱峰推測為大分子多糖的初步降解所需的熱量，未處理的多糖和汽爆后的多糖分別在178.99，184.04 ℃開始分解。汽爆后，牛膝多糖的焓變值由6.87 J/g降至5.23 J/g，峰值溫度由191.50 ℃升到197.83 ℃，推測是由于汽爆過程中，部分大分子多糖有一定程度的降解導致。3號峰為一個放熱峰，是由于多糖熱解或氧化分解產生的熱。汽爆后，牛膝多糖在該行為下變為寬峰，并且熱焓(6.79 J/g)遠低于未處理多糖的熱焓(62.64 J/g)。

圖6 蒸汽爆破處理和未處理牛膝多糖DSC曲線

2.5 牛膝多糖紅外表征

通過傅里葉紅外光譜掃描對牛膝多糖主要的官能團進行表征。如圖7所示，未爆破處理牛膝多糖的紅外光譜圖中，代表O—H的3 310 cm-1左右寬闊的吸收峰和代表C—H 的2 938 cm-1左右的強吸收峰為多糖結構的主要譜帶[24]。在1 020 cm-1處的吸收，表明糖單元中C—O—C的變形振動[25]。2 935 cm-1處吸收峰為C—H的亞甲基峰，928 cm-1處的尖峰為呋喃環的吸收峰[26]，由此可判斷該提取物是一種呋喃型雜多糖。方積年等[27]曾從牛膝中分離出肽多糖，因此1 654，1 548 cm-1處的強吸收特征峰應為羰基鍵的伸縮振動和N-H鍵的彎曲振動[28]。蒸汽爆破處理后，多糖在3 411 cm-1左右的O—H和2 939 cm-1左右的C—H特征譜帶被保留。由圖7中a譜帶可知。在1 740 cm-1處出現較強吸收峰，應為C=O的伸縮振動[29]，同時1 548 cm-1處代表N—H的吸收峰消失。

表4 牛膝多糖的熱力學參數

a. 蒸汽爆破處理 b. 未汽爆處理

2.6 牛膝多糖體外抗氧化活性

圖8可以看出，牛膝多糖對2種自由基的清除能力都隨著濃度的增加而增強。對汽爆處理后和未處理的牛膝多糖清除自由基能力的比較，可以看到汽爆處理后，牛膝多糖的抗氧化能力明顯增強，最大清除率相比于未處理組顯著增加，原因是蒸汽爆破使一部分被包裹的多糖釋放出來，增加了多糖的含量和種類，從而提升了多糖的抗氧化活性。但均低于相同濃度的VC。在圖8(a)中，當樣品濃度為2 mg/mL 時，未處理組的DPPH自由基清除率達到77.9%，而汽爆處理組的清除率為90%。在圖8(b)中，同樣可以看出汽爆后的牛膝多糖對超氧自由基的清除率顯著提高，是未爆破組的1.3倍左右，汽爆處理組的IC50均低于未爆破處理組的。

3 結論

將蒸汽爆破技術應用于牛膝的預處理，可顯著提高牛膝多糖的提取率和抗氧化活性。經響應面分析法優化牛膝預處理的最優工藝參數為預浸泡含水率11%，汽爆壓力1.6 MPa，維壓時間63 s。經實驗驗證，此條件下預處理的牛膝多糖得率為11.88%，約為未處理的2倍。汽爆處理后，牛膝表面出現大的溝壑和空洞，比表面積增大，傳質阻力減小；牛膝多糖在熱穩定試驗中表現在裂解吸熱過程中焓變值的降低，峰值升高，放熱過程中焓變值的顯著降低；隨著蒸汽爆破強度的增加，可有效加強牛膝多糖對DPPH和超氧自由基的清除能力。本試驗結果為蒸汽爆破技術在植物多糖提取工藝中的應用提供了一定的理論依據。

圖8 牛膝多糖對DPPH自由基和超氧自由基的清除作用

Figure 8 Effects of scavenging DPPH radicals and superoxide radicals by steam-explosion pretreated and untreated AbPS