孕驢尿中雌激素類物質的組成及活性

左曉佳，張蓉銀，柴 婷，高維明

(新疆畜牧科學院 畜牧業質量標準研究所，烏魯木齊 830000)

天然的雌激素類物質最早是從馬尿中獲得的多種天然結合態雌激素的混合物，可以用于制備雌激素替代療法的藥物，對人體多種因雌激素缺乏而引起的更年期綜合疾病有較好療效，早在20世紀40年代，美國惠氏-艾爾斯特制藥公司生產的結合雌激素藥物倍美力就已經正式上市使用[1-2]。而目前該類原料藥的來源基本都是孕期馬尿，其他動物孕期尿液的研究鮮見報道。

馬屬動物的消化器官構造和代謝機能基本相同，理論上尿液中也應包括雌激素代謝的所有中間產物，即雌激素結構類似物。據世界糧油組織(FDA)統計，截至2013年，全球馬的存欄量5 977萬頭，驢4 353萬頭。中國養驢歷史悠久，家驢的遺傳多態性豐富[3]，據國家統計局公布的2017年統計年鑒，截至2016年，中國馬的存欄量達到550.7萬頭，驢456.9萬頭，新疆地區馬存欄量達到89萬頭，驢54.6萬頭。因此，驢尿將是獲得天然雌激素類藥物的又一強勢來源，同時也將為農牧民帶來極大的經濟效益。鑒于此，本研究通過采集懷孕6個月孕驢的尿液，提取雌激素類似物，通過動物試驗檢測其活性，為孕驢尿的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

孕驢尿采自懷孕6個月的新疆驢(新疆沙灣縣隆源養殖合作社提供)；試驗小鼠為50只SPF級昆明小鼠(新疆醫科大學醫學試驗動物中心提供)，雌性，18～19日齡，個體質量12～16 g，以陰門未開作為未性成熟標志。按小鼠個體質量隨機分為5組，飼養在SPF級動物房，保持12 h照明/12 h黑暗的光照周期，溫度(23±1)℃，濕度(60±10)%，自由飲水進食。

雌激素標準品：雌酮硫酸鈉標準品、馬烯雌酮標準品、17α-馬烯雌酮標準品(美國USP公司)、雌二醇、雌三醇(中國食品藥品檢定研究院)；DH100大孔吸附樹脂(鄭州勤實科技有限公司)；陽性藥物：紅利來結合雌激素片(新疆新姿源生物制藥有限責任公司，國藥準字H20090172)。

1.2 主要儀器

UPLC超高效液相色譜儀(Waters公司，美國)；RM 2126 組織切片機(Leica公司，德國)；LC-MS TQD三重四極桿液質聯用儀(Waters公司，美國)。

1.3 方 法

1.3.1 雌激素類似物提取 采集到的孕驢尿低溫避光靜置6 h，10 000 r/min 離心后，經0.22 μm微孔濾膜過濾去除不溶物，得到清澈明亮的黃色液體。采用固液萃取方式分離獲得雌激素類物質的混合物[4-5]，用DH100大孔樹柱層析，流速6 mL/min，按填料體積∶上樣體積=1∶10上樣，乙醇洗脫。再使用UPLC超高效液相色譜C18柱分離樣品[6-7]，流動相為V(乙腈)∶V(磷酸二氫鉀)=30∶70溶液，流速0.4 mL/min。在紫外檢測器215 nm下檢測目標產物峰。收集產物峰經質譜定性[8-9]。

1.3.2 純化產物活性檢測 參照文獻[10-11]的方法對小鼠進行處理。處理方式如下：試驗小鼠分別用280、140、70 ng/g提取物進行灌胃，每天給藥1次，以常規飼養為陰性對照組，陽性對照組用280 ng/g陽性藥物處理。

陰道開口時間及開口率：從第2天開始觀察陰道是否開口，記錄時間和數量，以開口>2 mm作為開口標準，最后計算陰道開口率。

子宮質量及子宮系數：最后一次給藥24 h后用乙醚麻醉處死，解剖后稱量小鼠個體質量及子宮質量，計算公式為子宮系數=子宮質量/體質量×100%。

陰道上皮組織切片：解剖后每組隨機選3只取陰道上皮組織(5 mm×5 mm×2 mm)，使用Bouin固定液(飽和苦味酸300 mL+甲醛100 mL+冰醋酸200 mL)固定5 h；用φ=50%酒精浸洗數次，之后逐級增加酒精體積分數(60%～100%)，各體積分數分別浸泡2 h至完全脫水；使用V(純酒精)∶V(二甲苯)=1∶1和二甲苯溶液

分別浸泡30 min進行透明化處理；然后浸在溶解并保溫55 ℃的石蠟內1 h，再將組織與石蠟一起包埋入包埋盒中，將組織待觀察面平鋪向下擺放好，并趕出氣泡；冷水中冷卻凝固后將蠟塊固定在切片機的持臘器上，以厚度5～7 μm 進行切片；將較好的切片在40 ℃水浴中鋪展，然后固定在載玻片上于烘箱45 ℃烤干；經HE染色(蘇木精5 min，伊紅2 min)，同樣上述方法脫水和透明化處理，之后用樹膠封固，加蓋蓋玻片，晾干后用顯微鏡觀察陰道上皮細胞的角質化情況。

1.4 統計分析

試驗數據用SPSS 22進行顯著性分析和單因素方差分析，對差異顯著的數據用LSD和S-N-K法進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 提取純化試驗中雌激素結構類似物的結構初步鑒定

避光靜置6 h后，經0.22 μm避光微孔濾膜多次過濾，最后用透明橙黃色的液體作為純化原料最好，超過則會引起雌激素類化合物的降解或析出。從圖1可以看出，洗脫液在0.95 min有一個明顯的特征峰與圖2一致，對照混合標準品(包括雌酮硫酸鈉、17α-馬烯雌酮、馬烯雌酮、雌二醇、雌三醇)液相譜圖(圖3)可以發現，該峰有可能是馬烯雌酮峰。

圖1 洗脫液超高效液相譜圖Fig.1 UPLC spectrogram of eluent

圖2 紅利來結合雌激素藥物液相譜圖Fig.2 UPLC spectrogram of conjugated estrange drug Honglilai

鑒于此，分離該峰進行質譜分析，結果如圖4所示，可以明顯看出有一個質核比為267.31的物質響應強烈，對比馬烯雌酮分子質量可以斷定該物質為馬烯雌酮的母離子，證實液相對比的分析結果，定量分析其質量濃度為500 μg/mL。

圖3 混標液相譜圖Fig.3 UPLC spectrogram of mixed standards

圖4 馬烯雌酮質譜圖Fig.4 Mass spectrogram of equilin

2.2 純化產物活性評價

2.2.1 陰道開口時間及開口率 由表1可知，陽性對照組和處理組都從第3天給藥結束后，開始有陰道開口現象，之后逐天增加，而陰性對照組直到試驗結束也未有陰道開口的小鼠出現。所有處理組小鼠無體質量明顯減少或死亡等不良現象。

結果表明，在純化的雌激素結構類似物作用下，小鼠呈明顯提前發育狀態，并且隨質量分數增加，陰道開口的小鼠數量呈明顯上升趨勢。280 ng/g組的開口率略低于陽性對照組。

2.2.2 子宮質量及子宮系數 由表2可知，2 個指標分析結果一致，4個給藥組與陰性對照組差異均極顯著(P<0.01)，陽性對照組和70 ng/g組差異極顯著(P<0.01)，與其他處理組差異不顯著，280 ng/g組和140 ng/g組與70 ng/g組差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 陰道上皮細胞角質化程度 小鼠性成熟后，陰道上皮細胞發生角質化，并隨著角質層的增厚出現脫落現象，因此，從小鼠陰道上皮細胞切片圖能直觀地看出陰道角質化程度。從圖5可以看出，陰性對照組陰道上皮細胞完整，未見角質化，陽性對照組角質化明顯，各處理組均有較明顯的角質化，甚至140 ng/g組程度比280 ng/g組和陽性對照組強烈。

表1 各組小鼠陰道開口狀態Table 1 Vaginal opening state of mice in each group

表2 子宮質量及子宮系數顯著性分析Table 2 Significance analysis of uterine massand uterine coefficient

注：同列數據不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercase letters in the same columns indicate significant difference (P<0.05), and uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

目前，治療雌激素缺乏癥所使用的藥物主要是從孕馬尿中提取的結合雌激素，是多種天然固醇類結合態雌激素的混合物[1-2]。早在20世紀30年代就圍繞其開展多方面的研究。

中國驢種資源豐富，然而隨著社會進步和運輸業的快速發展，驢在中國大部分地方的役用地位明顯降低，主要驢品種種質資源逐步退化，目前驢的飼養主要用于產皮、產肉、產奶，而尿液的利用研究鮮見報道。相較于馬，驢飲水量小，食量小，但纖維消化能力強，不易得消化器官疾病，對蛋白質的吸收略低于反芻動物，而高于馬、騾子。

圖5 陰道上皮組織切片圖Fig.5 Vaginal epithelial tissue slices

并且驢性成熟早，繁殖率比馬高，驢體內雌激素的代謝率理論上比孕馬高，從其尿液中應該能夠提取出更多的雌激素結構類似物。

本研究發現，孕驢尿中的確含有雌激素結構類似物并分離出馬烯雌酮，質量濃度約為500 μg/mL，同時發現有少量17α-馬烯雌酮的脫氫化合物和雌二醇的脫水產物，具體結構并不能確定，但已基本證實孕驢尿中同樣可以獲得雌激素結構類似物的混合物。

本研究中隨提取物的質量分數增加，陰道開口率明顯呈上升趨勢，然而280 ng/g組的藥效比280 ng/g的陽性對照組略差，推測可能是由于提取物中除馬烯雌酮外，其他雌激素類似物的組成比例不同，協同效應不同。同樣可以解釋陰道上皮細胞觀察到的角質化結果，140 ng/g組角質化比陽性對照組更明顯。子宮系數也證明140 ng/g和280 ng/g 組和陽性對照組均與陰性對照組差異極顯著(P<0.01)，說明孕驢尿中獲得的雌激素結構類似物同樣具有令小鼠性成熟提前的效果，可以考慮作為替代藥物來源。

試驗還發現，提取物與陽性藥物的藥效差異較小，而且140 ng/g組和280 ng/g組藥效差異不大，從成本考慮，孕驢尿中提取的雌激素類物質將成為更低廉高效的原料藥物。然而從子宮質量數據中也可以看出，提取物的子宮質量低于陽性藥物組，從另一方面說明提取物的純度還有待提高，純化方法還有待優化，混合物中除馬烯雌酮外其他組分的結構還有待進一步確認。

4 結 論

發現孕驢尿中存在和孕馬尿中相似的成分，尿液原樣中含有馬烯雌酮500 μg/mL，此外還檢測到其他雌激素結構類似物，具體結構還有待證實。該提取物具使小鼠性成熟明顯提高的藥效。