莖尖轉化法轉基因小麥后代的遺傳特性分析

董福雙，劉永偉，呂孟雨，周 碩，楊 帆

(河北省農林科學院 遺傳生理研究所，河北省植物轉基因中心，石家莊 050051)

目前大多轉基因技術，都離不開組織培養，存在著受基因型限制、操作復雜、需借助抗性標記篩選、周期長、轉化效率低、轉化結果不穩定等突出問題。為了避免以上問題，利用植物活體直接轉化也受到諸多研究者們關注，如花粉管道法、種子吸漲法、植物莖尖轉化法等[1]。農桿菌轉化微創芽生長點法是以植物莖尖為轉化受體的一種活體轉基因方法，可擺脫離體培養技術，適合于組織培養困難型的作物品種，已在向日葵[2]、棉花[3]，苜蓿[4]玉米[5]、水稻[6]、小麥等[7-8]作物中有轉化成功的報道，并且在一些作物中獲得較高的轉化效率。但以往研究大多集中在轉化方法和轉化技術方面，至于轉化成功后對外源基因在遺傳后代的遺傳分析并未見報道。轉基因植株的后代遺傳分析鑒定，不僅是直接檢驗轉化效率、轉化技術和轉化條件的最有效手段，而且是研究外源基因在轉化后代中的整合、遺傳分離組合、表達規律等方面的基礎,更重要的是對轉化品系的實際應用價值的判定和將具有優良農藝性狀的其他外源基因的成功轉化，以及轉化后的整合、表達規律和應用提供理論和技術依據。

本試驗以“農桿菌轉化微創小麥芽生長點法”獲得的3個世代轉基因小麥后代為研究材料，通過對轉基因后代的檢測及遺傳規律的分析，探討外源基因在轉化后代中的遺傳分離規律，為其應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

利用“農桿菌轉化微創小麥芽生長點法”獲得的小麥品種‘金禾9123’‘石4185’‘周麥18’‘濟麥22’等轉基因小麥后代株系為試驗材料。編號為08D、10D的株系，轉化所用質粒為pCAMBIA-2201含有新霉素磷酸轉移酶基因(npt-Ⅱ)和β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)；其他轉基因株系轉化所用質粒為pCAMBIA-3301含雙丙氨酰磷抗性基因(bar)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)。

1.2 方 法

1.2.1 轉基因材料的獲得 利用“一種充分微創種子芽生長點的單子葉植物轉基因方法”(專利號：2012103003229)轉化小麥：用攝子掰去萌動1～2 d 小麥胚芽鞘和部分葉片暴露出生長點，利用農桿菌侵染微創后的生長點進行活體轉化，轉化后的小麥按單株收獲T0種子，將T0種子萌發成苗進行抗性篩選及分子檢測，獲得T1代轉基因植株。經抗性篩選及分子檢測為陽性的T1、T2、T3和T4代植株也按單株播種或收獲。

1.2.2 轉基因后代的抗性篩選 將轉入新霉素磷酸轉移酶基因(npt-Ⅱ) 的后代材料，進行抗卡那霉素篩選：75 mg·L-1卡那霉素溶液浸種36 h左右至發芽，擺放到用水浸濕的蛭石培養缽中，25 ℃下每天光照 14～16 h培養, 7 d后統計結果中白化的為非抗性株[10]。

將轉入雙丙氨酰磷抗性基因(bar)的后代材料，進行抗除草劑(PPT)篩選：將種子胚向上擺放于蛭石中，于25 ℃、16 h/d光照條件下7 d左右，待苗長至兩葉一心后，將第1片葉正面用記號筆劃一橫線，在橫線處正反兩面涂抹100 mg/L的PPT溶液，于25 ℃、16 h/d光照條件下培養7 d后統計結果，以葉片保持綠色不變黃的為抗性植株，葉片黃化失綠的為非抗植株。

1.2.2 轉基因后代的分子檢測 用2×CTAB法提取具有PPT抗性植株葉片的基因組DNA。新霉素磷酸轉移酶基因(npt-Ⅱ)的PCR檢測引物序列為：5′-CCACCATGATATTCGGCAAC-3′和5′-GTGGAGAGGCTATTCGGCTA-3′。雙丙氨酰磷抗性基因(bar)的PCR檢測引物為：P1:5′-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′和P2:5′-GTCTGCACCATCGTCAACC-3′；2種基因擴增片段長度為500 bp。反應體系為20 μL包含1 UTaq酶，2種引物為0.25 μmol/L，250 μmol/L的dNTP。程序為：95 ℃預變性3 min,95 ℃45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min 循環35次，72 ℃。PCR產物經15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離并照像。取陽性植株PCR產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠80 V穩壓電泳1～2 h后，按分子克隆中的方法(molecular cloning)將DNA轉移至尼龍膜上，以npt-Ⅱ/bar基因做探針與之進行雜交，按照Dig High prime DNA labeling and Detection Starter KitⅡ(羅氏公司)試劑盒進行。

2 結果與分析

2.1 轉基因后代材料的抗性篩選和分子檢測

將轉基因小麥后代材料，每個世代均按單株收獲，萌發種子成苗，經過抗性篩選(圖1、圖2)和進一步的PCR檢測(圖3)來確認轉基因材料，并選擇部分陽性株進行PCR-Southern blot檢測，結果表明：經過抗性篩選的95%的抗性苗PCR分子檢測為陽性，選擇部分PCR陽性株進行PCR-Southern blot檢測均為轉基因的植株(圖4)。

圖1 轉基因后代的卡那霉素篩選Fig.1 Kanamycin screening of transgenic plants

圖2 轉基因后代的除草劑篩選Fig.2 Herbicide screening of transgenic plants

2.2 轉基因小麥后代檢測結果與分析

通過對“農桿菌轉化微創小麥芽生長法”獲得的3個世代的轉基因小麥后代分析，結果表明小麥轉基因后代出現遺傳分離，轉基因株和非轉基因株分離比例在大多數轉基因后代株系中并不規律，一般出現3種遺傳分離情況:①轉基因后代外源基因完全丟失，檢測不到外源基因；②轉基因后代能夠檢測到外源基因，但轉基因株和非轉基因株分離比例分散，偏離孟德爾遺傳分離規律；③轉基因后代能夠檢測到外源基因，并且轉基因株和非轉基因株分離比例符合孟德爾遺傳規律。

利用“農桿菌轉化微創小麥芽生長點法”獲得的T1代轉基因小麥，為外源基因插入整合世代，不存在遺傳分離現象，因此T1代轉基因植株檢測是用來統計轉化率的，未做遺傳分離統計分析。

1～19.檢測樣品 Samples； 0.空白對照 Blank；CK-.陰性對照 Negative CK；CK+.陽性對照 Positive CK;M.DL 2000 marker

T2代33個株系的677個轉基因單株分析檢

CK.陽性對照 Positive CK；1.空白對照 Blank CK；2.陰性對照 Negative CK；3～11.檢測樣品 Samples

圖4PCR-Southern檢測
Fig.4PCR-Southernanalysisoftransformants

測的結果表明，轉基因株與非轉基因株分離比例在T2代中出現2種遺傳分離情況：20個株系(占總株系的61%)中檢測不到外源基因，外源基因完全丟失；其余13個株系(39%)中檢測到了外源基因，但轉基因株與非轉基因株分離比例偏離孟德爾遺傳分離規律(表1)。

T3代42個株系的922單株檢測分析結果表明，轉基因株與非轉基因株分離比例在T3代轉基因后代出現3種遺傳分離情況：①有22個株系(55%)檢測不到外源基因，屬于完全丟失；②有19個株系(43%)能檢測到外源基因，但轉基因株和非轉基因株分離比例復雜；③有1個株系(2%)轉基因株和非轉基因株分離比例符合孟德爾分離(表2)。

表1 T2代檢測到外源基因株系的分離情況Table 1 Statistical table of transgenic T2 generation

T4代8個株系的160單株檢測分析結果表明，T4代株系的轉基因株與非轉基因株分離比例出現3種遺傳分離情況①檢測不到外源基因，屬于完全丟失占25%；在能檢測到外源基因但分離比例復雜的占50%，符合孟德爾分離定律占25%(表3)。

表2 T3代檢測到外源基因株系的分離情況Table 2 Statistical table of analysis of the transgenic T3 generation

注：“*”,χ2測驗分離比率符合孟德爾遺傳分離比例,下同。

Note: “ *”,χ2test separation ratio meets Mengdeer genetic separation ratio，the same below.

表3 T4代小麥轉基因植株的檢測結果Table 3 Statistical table of the transgenic T4 generation

3 討 論

采用“農桿菌轉化微創小麥芽生長點法”獲得轉基因小麥后代，外源基因遺傳表現不穩定，其株系之間遺傳分離比例呈現多樣性，并存在大量外源基因丟失情況，隨著世代的增加，外源基因遺傳穩定性有升高的趨勢。此結果與馬盾等[10]報到的花粉管道法獲得的轉基因后代外源DNA遺傳表現不穩定，遺傳分離呈多樣性的結論相似。而通過傳統方法(轉化技術中包括組織培養過程)獲得的轉基因后代多數符合孟德爾遺傳規律[11-15]。分析其原因可能如下：通過組織培養的方法獲得的轉基因植物，其中抗性篩選參與在愈傷組織誘導、不定芽分化、不定根形成等無性繁殖過程中，將未轉化或外源基因插入表達不穩定的細胞淘汰掉，留下表達穩定的細胞分化成植株，因此利用此途徑獲得轉基因后代更容易穩定遺傳。而利用芽生長點等活體轉化方法獲得轉基因植株，轉化技術中沒有抗性篩選無性繁殖培養的過程，那些插入不穩定的外源基因容易被保留下來，而在再一次的有性繁殖過程中更容易丟失，所以轉基因后代T2代丟失嚴重，隨著世代的增加外源基因遺傳穩定性有升高，也是必然趨勢。因此在活體轉化技術體系中如何提高轉基因后代的遺傳穩定性是改進轉化技術體系的關鍵因素之一。