芍藥根莖芽發育及更新規律的形態學研究

張建軍，楊 勇，于曉南

(1.北京林業大學 園林學院，北京 100083；2.花卉種質資源創新與分子育種北京市重點實驗室，北京 100083；3.國家花卉工程技術研究中心，北京 100083)

芍藥(Paeonialactiflora)一般被歸類為塊根型植物(ruberous roots)，其肥大的塊根由側根或不定根膨大而成[1]。根莖(rhizome)，是植物的根狀地下莖，外形似根而有節。在根莖節上所產生的芽即為根莖芽(rhizome buds)[2]。根莖芽在植株再生、生態適應性、抗逆性等生物學性狀及產量等經濟性狀形成中所具有的重要價值而得到廣泛而深入的研究[3-7]。芍藥的再生莖枝主要來源于地下短縮莖(即根莖)上的芽，其發育質量與數量直接關系到芍藥的再生、開花及越冬抗寒能力，是其營養繁殖和觀賞性狀得以形成的基礎[8]。

高等植物的生長發育是由芽頂端分生組織不斷產生重復單位，即葉元(phytomer)(又稱體節：metamer)的過程[9-10]。每個葉元包括兩類亞單位:節點亞單位和節間亞單位，前者產生側生結構( 包括葉片和腋芽)，后者形成莖結構。而且這種“節-莖-葉連續體”一旦形成，其結構在植物的整個生長發育過程中不會改變[11]，因而只需跟蹤觀察芽莖端分生組織的變化特征就能窺視其發育的全貌[12]。通常，植物在萌發前便在原基狀態下形成了一定數量的葉元及枝葉器官，這種預形成(preformation)特性在多年生植物中普遍存在[13]，一般認為，植物預形成程度的高低與其地理分布和抗寒能力密切相關[14]。

長期以來，與芍藥芽有關的研究主要集中在芽的頂端生長點的花芽分化過程及其與花型演變的關系[15-16]。而其他方面，如根莖的生物學特性、腋芽發生、發育規律及分枝特性等尚缺乏深入的認識和足夠的關注，極大阻礙了人們對根莖芽發生發育規律的研究。本研究以探討芍藥植株再生的生物學特性為目標，通過對根莖芽頂端分生組織的形態學觀察、根莖芽越冬休眠的預形成狀態剖析以及根莖早期結構的顯微觀察，闡明芍藥根莖及根莖芽的發生和發育規律，為掌握其根莖的變態類型和更新方式提供科學依據，為提高芍藥營養繁殖效率提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

2 a生芍藥‘大富貴’分株苗，種植于北京林業大學芍藥種質資源圃(北京市昌平區小湯山鎮)。

1.2 方 法

1.2.1 芍藥根莖的結構特征及更新方式 2014年秋季進行分株，每株留2～3個肉質根，4～5個芽。2015-10-05，剪去地上莖葉，將地下塊根整體起苗，剪除老根，去除泥土及雜物，拍照觀察根莖的結構和更新方式。

1.2.2 芍藥根莖芽的內部結構特征觀察 2015-10-05，將根莖頂部飽滿根莖芽從基部切下，用清水清洗外部泥土后，在體式顯微鏡(Leica DFC500)下剝除芽子外鱗，進行解剖學觀察。

1.2.3 根莖芽葉元發生與發育特征觀察 2015-06-02至2015-09-15，每10 d取樣1次，2015-09-15-2015-11-30，每5 d取樣1次，直至土壤封凍。每次挖取3株長勢一致的植株，取根莖最上部的飽滿芽5～10個，從芽基部切下，剝除頂部外鱗片，參照艾云苾等[15]的方法，全部用FAA固定液進行固定處理，4 ℃保存，備用。將固定好的材料置于體式顯微鏡(Leica DFC500)下，用精細顯微鑷將頂端組織器官層層撥開，直至露出頂端分生組織，拍照觀察。

1.2.4 越冬期芍藥根莖芽的預形成狀態觀察 2015-11-30，土壤封凍，按上述方法取芽5～10個，清水沖洗2～3次后直接置入固定液進行固定。按“1.2.3”所述方法，體式顯微鏡(Leica DFC500)下由芽基至芽頂逐節進行統計觀察。

1.2.5 芍藥根莖、莖及根的解剖結構觀察 2015-10-05，選用芽基部直徑1 cm左右的根莖芽，從根莖處開始切取根莖芽基部0.2～0.3 cm長圓柱塊；同時在根莖芽第1枚葉片位置往上切取0.2～0.3 cm長圓柱塊；選用直徑1 cm左右粗根，洗凈，切割成0.2～0.3 cm圓柱塊。將以上3種材料別用FAA固定，按照艾云苾等[15]的方法制作石蠟切片，顯微觀察。

2 結果與分析

2.1 芍藥根莖的結構特征及更新方式

根據生長年限的不同，將上一年度形成的根莖稱為母代根莖，其后產生的根莖稱為子代根莖。觀察發現，其基部的母代根莖(F1)外形粗壯，表皮與根類似，其上著生有大量的不定根(圖1-A)和褐色根莖芽(圖1-B)，其頂端可見殘留的腐朽

AR.Adventitious root不定根; St.Stem 莖; RC.Rhizome bud根莖芽; F1.The first generation第1代根莖; F2.The second generation 第2代根莖；F3.The third generation第3代根莖; F4.The fourth generation第4代根莖; Sc.Scale鱗片

圖1芍藥根莖的結構特征
Fig.1TherootrhizomecharacteristicsofPaeonialactiflora

黑色的地上莖基，兩側各形成1個子代根莖，直徑稍小于F1,為F2代根莖(圖1-C)，其上也著生少量的不定根。F2代根莖頂端也宿存枯朽的莖稈，莖稈兩側又著生有1～2個子代根莖(F3)，F3直徑亦小于F2, 當年生根莖芽即著生于F3的頂端，其頂端宿存的莖稈為夏季開花后所宿存(圖1-C)。根莖芽為下一年度地上更新莖枝的來源，而其基部的短縮莖段為F4代根莖的早期狀態。此時(秋季)這個部位也有不定根的產生(圖1-D)。

芍藥的根莖由根莖芽實現更新生長，隨著生長年限的增長，根莖膨大增粗，最終芍藥根莖呈現類似合軸分枝的生長狀態，是地上莖枝和地下塊根進行連接的樞紐。

2.2 芍藥根莖芽的內部結構特征

對新鮮根莖芽進行剝鱗、切割處理并觀察，結果表明，芍藥根莖芽由頂芽、鱗片及鱗片腋部側芽組成(圖 2-A～C)。側芽按其有無鱗片包被可分為鱗片芽(圖2-D)和無鱗芽(圖2-E)。進一步觀察發現，芍藥的頂芽由頂端生長點、葉和腋芽組成，它們最后分別發育為頂蕾、葉片和側蕾。在側芽中，無鱗芽常為4～5個，與頂芽一樣，也由頂端生長點、葉和腋芽所組成。鱗片芽著生于無鱗芽下部，除多了1至數層鱗片外，其結構與無鱗芽一致。

Ph.Phytomer葉元; LB. Lateral bud 側芽; TB.Terminal bud 頂芽;Sc.Scale 鱗片;SB. Scale bud 鱗片芽; NB.Naked bud 無鱗芽

圖2芍藥根莖芽內部結構
Fig.2TheinnerstructureoftherhizomebudsofPaeonialactiflora

2.3 芍藥根莖芽葉元發生與發育特征

2.3.1 頂芽葉元發生與發育特征 6月初，從根莖處可以觀察到顆粒狀凸起的芽，此時芽已經形成了數枚鱗片。根莖芽基部最外層鱗片扁寬而出現膜質化脫落，上部黃白色鱗片層層緊裹，螺旋狀向頂式排列，鱗片腋內有腋芽原基的形成(圖3-A)。進入7月份，鱗片已分化至22～25枚。頂端分生組織繼續按照鱗片的著生順序產生凸起，形成葉原基(圖3-B)。與鱗片原基不同的是，葉原基凸起在產生后不久其兩側逐漸形成2個新的凸起，形成側小葉原基(圖3-C)。隨著葉腋處腋芽原基的出現，1個葉元單位形成，而此時頂端生長點已經產生3個新的葉原基(圖3-D)。隨著生長的進行，在最初形成的3枚小葉原基的基礎上各自繼續分化2枚側小葉原基，復葉結構形成。頂芽基部7～8個葉元單位所形成的葉均按照這種方式產生復葉結構，隨著生長節位的升高，側小葉原基分化程度降低，到頂部2～3枚葉則不產生小葉，形成單葉，因而出現同株異型葉(圖3-E)。因而頂芽的葉元基本發生方式為葉-莖節-腋芽。隨著頂端分生組織的繼續增大，邊緣位置最高處產生凸起，呈淺杯狀，苞片原基開始形成(圖3-E)，自此芍藥頂芽進入生殖生長期。此時葉原基數目為12～14枚。此后，分生組織繼續向上生長，但邊緣明顯快于中間，因而花托盤變寬、變深，苞片原基位于花托盤最上部邊緣。從苞片原基開始，花原基呈向基式發生發育。苞片原基繼續按葉原基的發生順序產生，呈螺旋狀排列。在5枚苞片原基突起產生后，繼續在其內側2枚苞片原基的交接處產生新一輪凸起，為萼片原基(圖3-F)。苞片原基和萼片原基的從形態上區分并不明顯，只能根據產生的先后順序進行區分，最先產生的5枚為苞片原基，隨后產生的5枚為萼片原基。此后分生組織邊緣生長進一步加快，花托盤繼續擴大、加深。于最先產生的萼片原基兩側先后產生突起，第1輪花瓣原基開始形成(圖3-G～H)。花瓣原基層層交錯排列，至11月初已經產生3～4輪花瓣原基形成(圖3-I)。

AB.Axillary bud腋芽原基；Sc.Scale 鱗片；Le.Leaf primordium葉原基；Br.Bract primordium苞片原基；Se.Sepal primordium萼片原基；Pe.Petal primordium花瓣原基

圖3芍藥頂芽的葉元發育特征
Fig.3Developmentalcharacteristicsofphytomerofterminalbudinrhizomebuds

2.3.2 側芽葉元的發生與發育特征 進一步對側芽(鱗片芽和無鱗芽)葉元的發生、發育狀況進行研究，結果表明，側芽葉原基(或鱗片原基)和根莖芽鱗片原基的產生并不同步，在第4枚鱗片原基凸起出現時，鱗片腋部產生圓弧狀凸起，形成早期側芽。隨后在側芽原基一側產生凸起，側芽的第1枚鱗片或者葉原基開始形成(圖4-A)。隨著原基的生長，然后在其相對180°的位置產生側芽的下一個葉原基或鱗片原基，此時側芽頂端分生組織呈凸起的弧狀(圖4-B)。隨著2枚原基的增大，第3枚原基在2枚原基對稱位置處出現，不久，第4枚原基也在第3枚原基的相對180°位置出現(圖4-C～D)。而第5枚原基在第2枚和第3枚原基的接合處開始出現，此后便按照螺旋狀的先后順序產生(圖4-E～F)。側芽的腋芽原基也在葉或鱗片產生后才發生，因而側芽的葉元基本發生方式與頂芽基本相同，為葉(或鱗片)-莖節-腋芽，不同之處在于前4個葉元的葉片(或鱗片)以交互對生方式著生。

芍藥根莖芽由側芽發育而來，綜合以上頂芽和側芽葉元發生方式的研究結果，根莖頂部一個完整的根莖芽的葉元發生模式為鱗片-莖節-側芽-葉-莖節-腋芽。第1至第4枚鱗片原基按交互對生方式發生，從第5枚鱗片原基開始按照螺旋狀排列，這種著生方式一直持續到花瓣原基的形成。

2.4 芍藥越冬期根莖芽的預形成狀態

2.4.1 不同莖節側芽的預形成狀態 在“2.2”的基礎上，進一步對不同莖節進行觀察研究。11月底，夜間氣溫下降至0 ℃以下，土壤開始封凍。對這一時期的根莖芽各節位(莖節節位)腋芽的預形成狀態進行觀察。結果表明：由根莖向上，根莖芽1～14節位側芽分化出4～7枚鱗片原基(圖5-A)，第15節位側芽分化出3枚鱗片，同時產生5枚葉原基，第16節位側芽分化出3枚鱗片和6枚葉原基，第17節位側芽分化出4枚鱗片和7枚葉原基，另頂端有3枚凸起。第18節位側芽分化出2枚鱗片和6枚葉原基，頂端進入花瓣原基分化狀態(圖5-B～C)。第19～22節位的側芽均為裸芽，其外無鱗片包被，其頂端分生組織均進入花瓣原基分化狀態(圖5-D～F)。

AM.Apical meristem頂端分生組織；Le.Leaf primordium葉原基; Le1.The first leaf primordium第1枚葉原基; Le2.The second leaf primordia第2枚葉原基; Le3.The third leaf primordium第3枚葉原基; Le4.The fourth leaf primordium 第4枚葉原基; Le5.The fifth leaf primordium 第5枚葉原基; Sc1.The first scale primordium第1枚鱗片原基; Sc2.The second scale primordium第2枚鱗片原基;Sc3.The third scale primordium第3枚鱗片原基

圖4芍藥側芽的葉元發育特征
Fig.4Developmentalcharacteristicsofphytomeroflateralbudinrhizomebuds

Sc.Scale鱗片;SB.Scale bud 鱗片芽;Pe.Petal primordium 葉原基;TB.Terrminal bud 頂芽; NB.Naked bud 無鱗芽

圖5越冬狀態下不同莖節側芽的預形成狀態
Fig.5Preformationstateofaxillarybudsofdifferentstemnodesofthelateralbud

根據“2.2”中對根莖芽頂端分生組織葉元的周年發育狀態的觀察，具備當年更新能力的根莖頂部的根莖芽在花后才形成葉原基，且在葉原基形成前形成的鱗片多達20余枚，因而這部分在越冬狀態下尚未形成葉原基的側芽(鱗片芽)所在莖節便是芍藥根莖的主要構成范圍，由此往上的莖枝在秋季枯萎，其與根莖結合部位的1～2枚根莖芽因而成為根莖頂部芽，承擔來年春季的抽枝展葉任務。而發育程度更低的多數根莖芽則與隨著根莖的發育而長期處于休眠狀態，并最終成為圓錐狀的棕褐色芽，其在一般條件下并不萌發。

2.4.2 頂芽不同節位腋芽的預形成狀態 對頂芽的觀察結果表明：由下往上，頂芽葉腋第1～9節位的腋芽仍處于圓弧狀凸起的原基狀態，未進入下一個分化階段(圖6-A～B)。從第10節位開始，腋芽部分進入萼片(圖6-C)或分化1～2枚葉原基后開始進入花瓣原基分化狀態，此為側蕾的早期發育狀態(圖6-D～F)。此時花托盤基部頂端分生組織的雄蕊原基內側同時產生5枚凸起，為雌蕊原基分化階段。

TB.Terminal bud 頂芽; Le.Leaf primordium 葉原基; AB.Axillary buds腋芽; MB.The mian bud 主蕾; Se.Sepal primordium 萼片原基; Pe.Petal primordium 花瓣原基; St.Stamen primordium 雄蕊原基; Pi.Pistill primordium雌蕊原基

圖6越冬狀態下頂芽不同節位腋芽的預形成狀態
Fig.6Preformationstateofaxillarybudsofdifferentstemnodesoftheterminalbud

2.5 芍藥根莖、莖及根的解剖結構特征

根據“2.3”對根莖范圍界定的研究結果，截取根莖芽著生葉片的莖段，根莖芽短縮基部及與之直徑相當的不定根，分別對其進行解剖觀察。結果表明：根莖芽基部的解剖結構與芽上部的莖的結構類似，根莖(圖7-A～C)與莖節(圖7-D～F)的髓部占據中央較大部分，細胞大，排列疏松。初生木質部和韌皮部主要分布在髓和皮層的中間呈環狀分布，表皮較薄，并有側芽(鱗片芽)產生(圖7-C～F)。而從根(圖7-G～I)的結構來看，表皮較厚，細胞致密，且木質部從根中央組織向四周呈輻射狀排列。

PF.Phloem fiber 初生韌皮部;PC.Parenchyma cell薄壁組織細胞; PX.Primary xylem初生木質部;Ep.Epidermis表皮;Sc.Scale 鱗片;Ph.Phloem 韌皮部; LB.Lateral bud側芽;Xy.Xylem木質部；Pe.Periderm周皮; Sp.Secondary phloem次生韌皮部; Vc.Vascular cambium維管形成層;Sx.Secondary xylem次生木質部

圖7芍藥根莖、莖及根的解剖結構特征
Fig.7Microstructurecharacteristicsofrootrhizome,stemandtuberousrootofPaeonialactiflora

3 討 論

芍藥根莖芽是芍藥更新枝的主要來源，是展葉開花的基礎。目前，對于芍藥根莖芽的發生和發育規律的認識有了一定的基礎，基本觀點為后續研究所廣泛引用[1,8,17-18]，但對根莖的性質及其莖節范圍，側芽發生發育規律以至于生物學意義未引起足夠的重視，因而芍藥根莖芽的研究長期多圍繞著頂端分生組織的分化過程和狀態這個內容而未有更進一步的突破[15-16]。確定根莖的范圍及其性質是對這一規律認識的基礎。本研究通過解剖觀察，認為芍藥根莖其實是芍藥的地下變態短縮莖，其外形雖與地下肉質根相似，內部結構與地上莖相似，而與根明顯不同，其通過以合軸分枝方式進行生長和發育，這與其他根莖型植物基本一致[19]。根莖節間發生不定根，頂端1～2枚根莖芽具備成枝展葉能力，從而實現芍藥每年1次的周年生長，這種根莖及其上的根莖芽和不定根便形成了一個完整的繁殖單元。因此，從這個意義上講，芍藥的芽為莖生芽，其分株繁殖實質上就是根莖的分株。

根莖芽的頂芽在形成的第2年春季展葉開花，因而其生命周期是2 a，而其側芽的生命周期呈現差異較大的3種發育方向：無鱗芽和其下方部分發育程度較高的鱗片芽隨頂芽生長或萌發成枝而形成“一芽多莖”，或隨根莖芽的鱗片的脫落而形成“一芽一莖”，其生命周期也是2 a，因而這部分芽與頂芽一樣屬于莖的范疇。而其他的側芽(均為鱗片芽)則屬于根莖芽，其最上部莖節1～2枚芽成為來年春天具有更新能力的根莖芽，因而其生命周期是3 a，而大部分根莖芽并不萌發成枝而于根莖上長期休眠。而此前的研究由于沒有重視根莖的發育特性，缺乏對側芽全周年發育周期的系統觀察，因而所得結論與本研究并不一致[1,17]。對根莖芽和側芽的這種分化發育規律、生物學意義及應用價值還有待深入。

一個完整根莖芽葉元(鱗片和葉)的發育方式包括從交互對生到螺旋狀著生的轉變過程，而且這種轉變在第5個葉元單位產生時就已經發生，這與此前的研究結果不同[19]。早期的葉元發育產生大量的鱗片和側芽，這種發育策略值得深入探討。而頂芽的葉元主要包括葉片、腋芽和莖節。頂芽葉片的螺旋狀的排列方式，可能是為獲得最大光合面積而進化的結果[20]。在根莖芽內，有葉(鱗片)必有腋芽(側芽)，但各莖節腋芽(側芽)的發育狀況與其所處節位密切相關。對‘大富貴’而言，頂芽頂部4～5枚腋芽在越冬狀態下進入花原基狀態，因而其在來年春季能形成“一莖多枝”的結構，其下腋芽原基雖然形成早，但隨后發育停滯，可能是受控于頂芽的頂端優勢的抑制所致[8,21]，具體發育調控機制需要進一步研究。