果膠酶對銅綠微囊藻蛋白表達的影響

沈清清，彭 謙，陳紅惠，賴泳紅，紀開艷

(1.文山學院 環境與資源學院，云南文山 663099；2.云南大學 微生物研究所，昆明 650091；3.云南文山學院 化學與工程學院，云南文山 663099)

銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是引起藍藻水華的主要優勢種[1]，它的泛濫生長給地球環境和人類的正常生活帶來巨大的危害，多年來技術人員采取基于物理、化學和生物原理的除藻技術來治理藻華[2-3]，但效果一直不理想甚至引出更多的環境負效應，因此人們仍然在尋找可持續和高效的除藻技術。銅綠微囊藻細胞壁的主要成分為果膠質，果膠酶(pectinase)具有將果膠質分解為多聚半乳糖醛酸的功能[4]。因此，果膠酶很可能具有導致銅綠微囊藻細胞衰亡的能力。基于以上理論基礎，沈清清等[5]研究果膠酶對銅綠微囊藻的作用效果，結果表明果膠酶能顯著抑制銅綠微囊藻的生長，但前提必須是在光照條件下果膠酶才能發揮此抑藻效應。

隨著分子生物學技術的發展，國內外學者已開始運用蛋白質組學手段研究不同環境脅迫條件下水華藻類的蛋白表達差異，以了解藻細胞脅迫反應的內在分子機制。 Choi等[6]分析暗培養和光培養條件下集胞藻(Synechocystissp.PCC 6803)中可溶性蛋白的表達差異，發現8種蛋白質(RbcS/L、CbbA、Gap2、AtpB、CpcB、PsbO、PsbU)與藻細胞的光合作用與呼吸作用密切相關。Fulda 等[7]研究鹽脅迫下集胞藻(Synechocystissp. PCC 6803)可溶性蛋白的表達情況，發現55個蛋白表達量明顯增加，并通過相關的研究證實轉錄后調節為集胞藻適應高鹽脅迫過程中主要的調節機制。因此本試驗從蛋白組學角度出發，在滇池中化感物質與藻華的關系研究課題組(以下稱本課題組)前期研究的基礎上，比較光培養和暗培養條件對果膠酶抑制銅綠微囊藻效應的影響，利用SDS-PAG技術分析果膠酶作用下暗培養組和光培養組藻細胞中蛋白質的變化動態，尋找有價值的蛋白質分子水平上的差異，結合差異蛋白的性質與功能探討果膠酶對藻細胞的效應機制，以期為銅綠微囊藻生理生態研究和果膠酶在藻華治理方面的應用提供理論基礎和幫助。

1 材料與方法

1.1 材 料

銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB 469) 購自中國科學院武漢水生生物研究所藻種保藏中心。

果膠酶：美國Sigma公司生產，酶活為400～800 U·g-1。

1.2 方 法

1.2.1 銅綠微囊藻的培養 在無菌條件下，采用無菌操作，將20 mL處于對數生長期的藻種接入裝有150 mL已滅菌的BG-11藻細胞培養液(pH 7.1)的三角瓶中，在溫度為(25±2) ℃、光照度約3 000 lx、每天光照12 h培養，人工每天振搖6～9次，擴大培養15 d。

1.2.2 果膠酶的固定化處理 將w=4%海藻酸鈉與w=4%明膠各100 mL于80 ℃水浴中混合溶解，約1 h后將混合液降至50 ℃左右，加入w=2%果膠酶液100 mL攪拌2～3 min，待充分混合后加入w=5%戊二醛15 mL攪拌均勻，保持混合液在50 ℃水浴中，制成小球。靜置2 h后放入w=0.05% 戊二醛中固定過夜(4 ℃冰箱中浸泡)，濾出小球并以蒸餾水洗滌數次，濾紙吸干，4 ℃保存，備用[5]。固定化果膠酶酶活為4～8 U·g-1。

1.2.3 果膠酶作用藻細胞 嚴格采用無菌操作，將培養15 d的銅綠微囊藻液倒入已滅菌的1 000 mL大三角瓶充分搖動混勻分別取150 mL藻液裝入250 mL三角瓶(初始藻細胞濃度約為2.8×107mL-1，葉綠素a質量濃度4 mg·L-1)。分為對照組(光)、對照組(暗)、光培養處理組和暗培養處理組共4組進行試驗[下文圖表中分別采用control(light)、control(dark)、light、dark表示]，每個組設3個平行，采用一次性培養方式進行試驗。對照組(光)：藻液在“1.2.1”培養條件下培養；對照組(暗)：裝有藻液的三角瓶用鋁箔嚴密包裹，置于無光箱培養。光培養處理組：藻液中加入15 g果膠酶，搖勻后在“1.2.1”培養條件下培養；暗培養處理組：藻液中加入15 g果膠酶，三角瓶用鋁箔嚴密包裹，置于無光箱，溫度為(25±2) ℃，人工每天振搖6～9 次培養。

1.2.4 藻細胞全蛋白分離與鑒定全蛋白分離 分別提取對照組(光)、對照組(暗)、光培養組和暗培養組條件下培養的藻細胞全蛋白。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，分離膠濃度φ=12%，電極緩沖液為Tris-甘氨酸電泳緩沖液，銀染顯色[8]。

蛋白質譜鑒定：從凝膠上割下蛋白條帶，φ=30%乙腈，0.025 mol·L-1碳酸氫銨洗脫1次，之后再用φ=50%乙腈，0.01 mol·L-1碳酸氫銨洗脫一次進行脫水處理。脫水條帶裝入離心管-20 ℃下保存送檢。蛋白條帶利用美國ABI4700 MALDI串聯飛行時間質譜儀(MALDI-TOF/TOF)做質譜分析。

數據庫檢索：利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。利用Mascot軟件搜索SwissPort數據庫，尋找匹配的相關蛋白質且確定其功能，以明確鑒定出蛋白質的性質。查詢條件：MS-MS離子檢索，選用酶Trypsin，漏切位點l，一個樣品點的全部MS-MS峰值數據合并為一個檢索數據文件。固定修飾為Carbamidomethy(C)，可變修飾為Oxsidation(M)。

1.3 數據處理

采用SPSS 16.0軟件包和Microsoft Excel 2003進行ANOVA統計分析，以P<0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 光照和黑暗條件對果膠酶抑藻效應的影響

觀察果膠酶加入后在光照和黑暗條件下銅綠微囊藻的生長情況，如圖1所示，4個試驗組藻液培養第3天與第15天相比前后差異最大的為光培養處理組，藻液由黃綠色變為淺黃色；其次為對照組(暗)，藻液由深綠色變為淺綠色；而暗培養處理組和對照組(光)藻液顏色無明顯變化。

圖1 果膠酶對銅綠微囊藻生長的影響Fig.1 Effect of pectinase on the growing of M.aeruginosa

2.2 差異蛋白質的確定

為了解果膠酶對銅綠微囊藻細胞蛋白表達的影響，從各試驗組中取相同體積的藻液離心棄上清獲得藻細胞后提取總蛋白進行分析。總蛋白的SDS-PAGE分析結果如圖2所示，試驗第3天時4個試驗組藻細胞表達的蛋白組分無差異，但在蛋白豐度上卻存在差異，其中對照組(光)(泳道6)、對照組(暗)(泳道9)和暗培養處理組(泳道2)3個試驗組相同Rf值位置處的各蛋白譜帶的豐度無明顯差異，而與這3組相比光培養處理組(泳道3和泳道7)在譜帶的蛋白豐度上差異顯著，尤其在2～105 ku的多肽變化明顯，有多條蛋白譜帶顏色變淺，表明其含量降低，其中約42 ku和68 ku處的2條譜帶(分別命名為ADa和ADb)顏色最淺，著色模糊，甚至有消失的趨勢，這一現象與其他試驗組的ADa和ADb譜帶清晰及著色較深的情況形成鮮明對比。以上數據表明試驗第3天在光照條件下果膠酶能使銅綠微囊藻細胞某些種類的蛋白表達量減少，而黑暗條件下無此效應，結合“2.1”結果分析表明光照條件下ADa和ADb蛋白豐度的降低與藻細胞的消亡有一定的相關性。另外，本試驗對處理第30 天的藻細胞總蛋白也進行了SDS-PAGE分析，發現光培養處理組(4和8泳道)的蛋白譜帶與處理第3 天的相比無論在蛋白組分還是在蛋白豐度上都有極顯著差異，分析其原因可能是果膠酶長時間作用藻細胞后，使果膠酶中的蛋白成分分解或藻細胞死亡后胞壁破損，胞內大量的蛋白類物質分解釋放的緣故，另外經過30 d處理，細胞數量變化很大，取與試驗第3天相同體積的藻液進行分析所造成的誤差相對也比較大，為此，針對這一方面不再進行研究與討論。 Pandey 等[9]研究了聚球藻(Synechococcussp. PCC 7942)在不同光源條件下蛋白質的表達差異，發現對黑暗適應的聚球藻細胞能產生8種特有的多肽，表明利用黑暗能誘導藻細胞合成新的多肽。而本試驗中未發現相似的現象。

0、1. Marker；2.果膠酶處理第3天的樣品(黑暗) Tracks represent the proteins that separated fromM.aeruginosacells after treatment with pectinase on the 3th day(dark);3、7.果膠酶處理第3天的樣品(光照) Tracks represent the proteins that separated fromM.aeruginosacells after treatment with pectinaseon the 3th day;4、8.果膠酶處理第30天的樣品(光照) 4 and 8 tracks are the proteins of 30th day in the experiment(light);5.果膠酶 Pectinase；6.對照樣品(光照) Control(light)；9.對照樣品(黑暗) Control(dark)

圖2SDS-PAGE分離藻細胞全蛋白
Fig.2SDS-PAGEseparationoftotalproteinsfromM.aeruginosa

2.3 蛋白質譜分析

為進一步認識變化最顯著的ADa和ADb蛋白與藻細胞生長的關系，將6泳道中相應Rf值位置處的ADa和ADb條帶割下，用MALDI-TOF/TOF質譜儀分析鑒定，僅獲得ADa蛋白的詳細數據，分析ADb不能解出的原因可能是蛋白未達到質譜對樣品的要求。如圖3所示MALDI-TOF/TOF質譜分析顯示在質荷比(m/z)為976.404 5、1 132.485 8、1 198.655 4、1 790.824 8和2 211.011 0這5個離子信號位點的特征峰相對豐度較高，對這5個肽段碎片進行二級質譜分析得到精確結果。利用Mascot軟件提交至數據庫查找相匹配的蛋白質[10]。檢索結果顯示肽序列和Microcystisaeruginosa在數據庫中的蛋白序列比較無顯著相似性結果，推測該蛋白為功能未知的新蛋白。

圖3 蛋白的MALDI-TOF-TOF一級質譜分析Fig.3 The first MALDI-TOF-TOF mass spectrum analysis of proteins

2.4 蛋白的鑒定與分析

為確定ADa蛋白的屬性，檢索所有物種數據庫蛋白，結果顯示該蛋白與許多真核生物中的actin 蛋白都有不同程度匹配分值(表1為8類較高匹配值的蛋白參數)，如綠藻Mesostigmaviride肌動蛋白(actin)(SwissPort數據庫中編號為ACT-MESVI)，結果匹配得分56，大于25(P<0.05)，可信度較高。長期以來，人們認為原核細胞中缺乏細胞骨架結構，只有真核生物中才能找到。但近年來，許多種類的原核生物中都發現了細胞骨架蛋白的存在，并且在功能與結構上與真核生物相似，具有決定細胞形態、調控染色體分離、維持生物活性和調控細胞壁合成等方面的功能[11]。Carballido[12]研究發現細菌中存在肌動蛋白絲類似物MreB、ParM和MamK，微管蛋白類似物FtsZ和BtubA/B和中間絲類似物CreS；人們也在魚腥藻(Anabaenasp．PCC 7120)中發現了MreB[13]和FtsZ[14]； Guljamow 等[15]發現在銅綠微囊藻PCC 7806的基因組中存在一個基因島，這個基因島編碼兩類蛋白即actin(肌動蛋白)和profilin(肌動蛋白的結合蛋白)，這兩類蛋白與真核生物的相關蛋白具有高度同一性，林重陽[16]經研究推測Guljamow等[15]報道的銅綠微囊藻ActM蛋白可能是擬核區染色體的附著與支撐結構，具有近似真核生物細胞核骨架的功能。Kaneko 等[17]研究也發現銅綠微囊藻PCC 7806中存在MreB蛋白。由此推測ADa蛋白可能是與肌動蛋白有關聯的一類蛋白或是原核藍藻中的actin類似物；另外結合沈清清等[5]的研究結果觀察發現大量藻細胞表面結構有不同程度的損傷和缺失、細胞內物質降解斷裂的情況分析，ADa蛋白可能與維持細胞基本形態相關，后期本課題組將對該蛋白的功能及性質進行更深入的研究。

表1 SwissPort數據庫中檢索結果Table 1 Result of searching SwissProt protein database

3 討論與結論

銅綠微囊藻是喜光物種，藻華爆發的時節正是光照強和日照時間長的夏季，光照對銅綠微囊藻生長具有重要意義。諸多研究表明，藻類在光照弱或黑暗條件下對外界刺激耐受力較弱，且生長較容易受到抑制[18]；另外，低光照會使藻細胞分泌的胞外多糖含量下降及群體尺寸變小[18-19]；一些研究還報道抑藻劑在黑暗條件下的抑藻效果更為顯著，原因可能是光合作用的停止限制了藻細胞對營養元素的吸收，從而抑制藻細胞的生長，在此情況下，抑藻劑更易侵蝕藻細胞，導致藻細胞死亡[20-21]。然而，本試驗結果卻表明黑暗條件反而有助于銅綠微囊藻抵抗果膠酶的損傷效應，甚至黑暗條件下果膠酶對其生長有緩慢的促進作用，表明光照條件是果膠酶對銅綠微囊藻起抑制作用的一個敏感條件。林必桂等[22]在研究賴氨酸的抑制作用時發現，光照條件下賴氨酸對銅綠微囊藻具有專性抑制作用，而黑暗條件下不同濃度賴氨酸對微囊藻均無明顯的抑制作用，質量濃度為2.0 mg·L-1的賴氨酸反而使處理的微囊藻葉綠素a 含量顯著增加，表明黑暗條件下微囊藻具有利用賴氨酸進行化能異養生長的能力。近年來，有研究發現有些藻類在遇到不良環境或極限條件時能夠生存下來，是因為它們會啟動一些保護機制清除能量消散、自由基等對光合系統及其他一些重要的細胞結構的損害，或采取減慢生長速率以保持細胞內穩態的生存策略[23-24]；另外，有研究還發現銅綠微囊藻不僅可以利用無機營養元素光合自養，還可以在無光照條件下生長于有機物中，利用小分子有機底物進行化能異養生長的能力，如藻類可在黑暗條件下利用糖類物質作為碳源維持細胞生長[25]。由此推測，本試驗中黑暗條件下銅綠微囊藻細胞可能選擇了異養生長途徑，藻細胞不再利用光合系統進行自養生長，細胞內的代謝調控機制發生改變，從而導致果膠酶無法發揮效應，但因為營養物質的缺乏，藻細胞也無法快速增殖，只能以緩慢生長甚至近似休眠狀態的方式存活下來；因此本課題組大膽推測果膠酶的作用位點之一可能在藻細胞的光合系統，接下來筆者也將從這一角度繼續探究果膠酶抑制銅綠微囊藻生長的分子機制。目前，關于抑藻物質對藻細胞蛋白質表達影響的研究較少，報道也主要集中在化感物質作用藻細胞方面，化感物質是指植物代謝過程中向外界分泌的化學物質[26]，其抑藻機制研究比較深入，其中一種機制就是化感物質會對藻細胞蛋白質的合成產生影響[27]。Wu 等[28]在馬來眼子菜與銅綠微囊藻的共培養體系蛋白質組學的研究中發現，馬來眼子菜的化感作用能導致銅綠微囊藻細胞內蛋白的降解，雙向凝膠電泳圖譜中差異較大的蛋白表達均呈2倍下調的趨勢。汪麗等[29]在研究荇菜種植水對銅綠微囊藻的效應時發現3種藻膽蛋白(包括藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白)相對含量均有不同程度的下降。本試驗結果也表明光照條件下果膠酶具有降解多種蛋白或抑制蛋白表達的效應，其中對ADa蛋白表現的效應最顯著。而黑暗條件下ADa蛋白豐度變化不明顯，表明ADa蛋白的減少與藻細胞消亡存在相關性且該蛋白與光合作用有一定的聯系。