2016～2017年四川地區PRRS病毒ORF5基因的遺傳變異分析

丁夢蝶 ，朱佳文 ，梁璐琪 ，張毅 ，陳斌 ，邵靚

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.成都市農林科學院畜牧研究所，四川 溫江 611130）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS，俗稱豬藍耳?。┯?987年首次在美國發現，我國于1996年首次分離到PRRSV美洲型經典毒株（CH-1a），2006年我國大面積暴發高致病性PRRS，給養豬業造成了巨大的經濟損失[1]。2013年以來，我國部分地區又出現了歐洲型PRRSV毒株[2]以及美洲型NADC30類病毒（NADC30-like）[3-4]。PRRSV 是單股正鏈 RNA 病毒，基因組的變異使得新毒株不斷出現。ORF5編碼主要囊膜蛋白GP5，該蛋白是病毒與細胞受體結合區，包含病毒中和位點，在結構蛋白中變異率最高，因此ORF5基因是研究PRRSV遺傳進化及分子流行病學的重要靶基因。本研究應用RT-PCR法從2016～2017年采集自四川地區的疑似PRRSV感染病料中擴增ORF5基因，并進行序列分析，以了解近兩年來PRRSV在四川地區的流行特點，為有效防控該病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料 疑似PRRSV感染豬病料來自于2016年和2017年四川地區的流行病學調查采樣，保存于-80℃。

1.2 主要試劑 柱式RNA提取試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；RT-PCR一步法試劑盒，購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.3 樣品處理 取病死豬的組織樣品，用無菌鑷子剪碎，加入滅菌PBS（pH 7.2），然后在樣品制備系統中破碎，離心后取上清用于RNA提取,提取步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 ORF5基因的擴增和序列測定 使用Zhou L等[5]設計的引物ORF5-F、ORF5-R擴增ORF5基因，預期擴增片段長度為682bp。RT-PCR擴增反應體系：25μL 2×1step buffer、2μL Enzyme mix、上下游引物各 1μL（20μmoL）、4μL RNA、17μL RNase Free H2O，反應總體積為50μL。RT-PCR反應條件：50℃ 30 min，94℃ 2min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 50s，共 32 個循環；72℃ 8min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認有目的條帶后送上海生工進行T載體克隆和測序。

1.5 ORF5基因的序列分析 應用DNAStar軟件對所測得的ORF5基因序列，以及CH-1a（AY032626）、JXA1 （EF112445）、VR-2332（AY150564）、NADC30（JN654459）、QYYZ（JQ308798）、LV（M96262）等參考毒株的ORF5基因序列進行同源性分析和序列比對。用MEGA6軟件Neighbor-Joining法進行遺傳變異分析，設置自展值（bootstrap）為1000，構建系統進化樹。

2 結果

2.1 ORF5基因的測序結果 經測序后共得到12個ORF5基因序列。對測序結果進行剪切后，長度均為603bp，編碼200個氨基酸。

2.2 序列同源性分析 12個ORF5基因序列之間的核苷酸序列同源性為82.3%～99.8%，推導的氨基酸序列同源性為81.1%～99.5%。與美洲型毒株CH-1a、JXA1、VR-2332、NADC30、QYYZ 的 ORF5 基因的核苷酸序列同源性分別為85.1%～95.4%、83.6%～99.5%、85.1%～89.4%、83.9%～94.2%、82.8%～90.9%，與歐洲型代表株LV的核苷酸序列同源性僅為61.4%～64.6%；推導的氨基酸序列同源性分別為85.6%～93.5%、83.6%～98.5%、83.1%～88.6%、84.1%～93.5%、80.6%～93.0%，與LV氨基酸序列的同源性僅為53.3%～58.9%。

2.3 遺傳變異分析 基于ORF5基因序列構建的遺傳進化樹如圖1所示。

圖1 基于ORF5基因序列的遺傳進化樹

PRRSV毒株分為美洲型（Type 2）和歐洲型（Type 1）兩個基因型。美洲型毒株可以分為5個亞群，分別以JXA1、CH-1a、NADC30、VR-2332 和 QYYZ 毒株為代表。本研究中的12個序列均屬于美洲型，其中有10個 （O-01-2016、O-02-2016、O-03-2016、O-04-2016、O-01-2017、O-02-2017、O-03-2017、O-04-2017、O-07-2017、O-08-2017）屬于以 JXA1 毒株為代表的 I亞群，另 2個（O-06-2017、O-05-2017）分別屬于以NADC30株為代表的Ⅲ亞群和以QYYZ毒株為代表的V亞群。

2.4 ORF5基因推導的氨基酸比對分析 抗原表位區域和毒力位點均存在氨基酸變異。與所在亞群的代表株相比，在 B 細胞表位 1（27～30aa）中，O-08-2017株發生 V29→A29突變，O-06-2017株發生A27→V27突變；在 B 細胞表位 2（37～45aa）中，O-02-2016株發生I39→F39突變；在B細胞表位3（180～197aa）中，O-02-2016株發生 L196→Q196突變，O-04-2016株發生 R191→K191突變，O-07-2017、O-08-2017株發生L196→R196突變。在T細胞表位區域，與所在亞群的代表株相比，I亞群中O-02-2016株發生 I121→V121、V124→I124突變，O-07-2017株發生R151→K151突變，O-08-2017株發生I121→L121突變；Ⅲ亞群中O-06-2017株發生120LI121→120FF121、K129→R129、K163→R163 突變；V亞群中O-05-2017株發生F117→L117、I121→T121、I124→V124、Y153→H153 突變。在毒力位點的第 13 位 aa，O-05-2017、O-06-2017 株為 Q13，其余為 R13；第 151 位 aa，O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017株為K151，其余為R151。

3 討論

在PRRSV的結構蛋白中，普遍認為編碼GP5蛋白的ORF5基因最容易發生變異，因此可通過分析ORF5基因的變異情況來研究PRRSV的分子流行病學[6-7]。PRRSV主要分為以LV株為代表的歐洲型毒株和以VR-2332株為代表的美洲型毒株，兩者之間的核苷酸序列同源性約60%。本研究中12個美洲型ORF5序列與LV株ORF5基因的核苷酸序列同源性僅為61.4%～64.6%，符合這一現象。此外，雖然都屬于美洲型，但12個ORF5序列之間的核苷酸序列和推導的氨基酸序列的同源性相互之間有較大差異，也符合ORF5基因變異大的特點。

PRRSV流行毒株的ORF5基因在抗原表位區域和毒力位點均有發生氨基酸突變的報道[8]。在抗原表位區域有6個ORF5序列（O-02-2016、O-04-2016、O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017、O-08-2017）發生了以下突變：A27→V27、V29→A29、I39→F39、I121→V121、V124→I124、K163→R163、R191→K19 1、L196→R196、L196→Q196 等。這些突變可能會引起抗原性改變，進而影響疫苗免疫效果。在毒力相關位點，強毒株為R13和R151，弱毒株為Q13和G151。在第 13 位 aa，2 株（O-05-2017、O-06-2017）出現毒力致弱（R13→Q13）；在第 151位 aa，3株（O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017）可能出現毒力改變（R151→K151）。此外，已知ORF5序列的前31位氨基酸為信號肽序列，是GP5蛋白的高變區，本研究中除 O-02-2016、O-03-2016、O-04-2016 外的其他序列在第10～30aa均有氨基酸突變。

4 結論

本研究12個ORF5序列中，有10株與高致病性毒株JXA1的親緣關系較近，有1株與NADC30毒株的親緣關系較近，另1株與廣東分離株QYYZ的親緣關系較近，可見四川地區近兩年流行的PRRSV以高致病性的JXA1亞型為主，也有少量NADC30亞型和QYYZ亞型毒株出現，應密切關注。