DON、ZEA聯合染毒對體外培養雞脾臟淋巴細胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影響

張 卓，辜彥霏，陽莎莎，王亞超，鄧俊良，任志華*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130；2.西南科技大學，四川 綿陽 621010)

鐮刀菌毒素是導致全球食品、飼料業及養殖業經濟損失最大的一組霉菌毒素[1]。與家畜健康和生產有關的重要的鐮刀菌毒素是單端孢霉烯族毒素，即脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，玉米赤霉烯酮(ZEA)，T-2毒素和煙曲霉毒素。由于家禽對鐮刀菌毒素敏感性明顯低于豬，因此家禽鐮刀菌毒素中毒常表現亞臨床癥狀而容易被忽視。霉菌毒素性質穩定，在糧食的儲存和加工過程中不易被破壞，因此極易通過食物鏈引起人畜中毒[2]。

細胞因子可傳遞細胞間信息進而參與免疫應答全過程，其在免疫調控中起重要作用。國內外一些學者對DON、ZEA單獨染毒對脾臟細胞因子的影響進行了大量研究，結果表明，DON、ZEA單獨染毒均對細胞因子的分泌、基因表達有影響。Kinser等[3]利用芯片研究小鼠口服 25 mg·kg-1體質量的DON對其脾臟調節基因表達的作用，結果表明DON主要與免疫調節、炎癥有關的基因和趨化因子有關，主要誘導IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-11的分泌。Pestka等[4]給斷奶小鼠和成年小鼠以5 mg·kg-1體質量的劑量口服DON，結果DON影響了脾臟的INF-α、IL-1β和IL-6，其mRNA的表達斷奶小鼠是成年小鼠的2～3倍。Marin等[5]研究ZEA對豬的中性粒細胞的免疫反應時發現細胞增殖減少，IL-8顯著減少。

目前飼料受鐮刀菌毒素污染非常嚴重，尤其在四川等南方潮濕、多雨、日照短的亞熱帶濕潤氣候地區，DON和ZEA在飼料中的檢出率均嚴重超標[6]。因此，本實驗以原代培養雞脾臟淋巴細胞為模型，重點研究了DON、ZEA聯合染毒對雞脾淋巴細胞分泌促炎性細胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影響，為進一步闡明動物DON、ZEA中毒機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系

40～60日齡健康的伊莎公雞，購自東北農業大學動物醫學院動物中心。無菌摘取雞脾臟，放入裝有PBS液的培養皿中，清洗后剝離脾臟周圍結締組織。移至盛有PBS液培養皿中200目的銅網上，用無菌的注射器內芯研磨，使脾臟淋巴細胞進入PBS液中，過濾，并稀釋濾液到一定濃度。再將此細胞懸液緩慢移入裝有淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r·min-1，常溫離心15 min后移取淋巴細胞。將淋巴細胞用冷的PBS液和不含毒素含血清的RPMI1640完全培養液各洗滌1次，重懸，臺盼藍染色計數，細胞活力大于95%可用于后續實驗。

CCK-8法分別檢測了DON、ZEA致雞脾臟淋巴細胞半數抑制濃度(IC50)，DON的IC50為(30.82±10.48) μg·mL-1，ZEA的IC50為(23.91±4.96) μg·mL-1。前期實驗中DON、ZEA單獨染毒時高濃度均造成脾臟淋巴細胞的嚴重損傷，故在正式試驗中以DON、ZEA低濃度進行聯合染毒。DON、ZEA聯合染毒劑量為0.012 5 μg·mL-1和0.006 25 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1和0.025 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1和0.1 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1和0.4 μg·mL-1，分別設為DZ-1組、DZ-2組、DZ-3組和DZ-4組。

1.2 實驗材料

胎牛血清(FBS)(Gibco，美國)，Hepes、DON、ZEA及無酚紅的RPMI1640培養基(Sigma，美國)，細胞計數(CCK-8)試劑盒(DOJINDO，日本)，rTaq酶等PCR反應試劑(TaKaRa，日本)，Trizol試劑盒、M-MLV反轉錄酶(Invitrogen，美國)，溴化乙錠(EB)(美國Sigma)，雞的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測試劑盒(上海生物公司，中國)。

1.3 體外培養雞脾臟淋巴細胞上清液中細胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的測定

染毒48 h后收集細胞培養上清液，3 000 r·min-1離心20 min，吸取上清，-20 ℃保存備用。按說明書測定上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。

1.4 體外培養雞脾臟淋巴細胞內細胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表達測定

采用熒光定量RT-PCR法測定，淋巴細胞低溫充分勻漿后，用Trizol試劑抽提總RNA，使用M-MLV反轉錄酶反轉錄成cDNA。根據GenBank中發表的雞的全基因序列，應用Prime 5.0軟件設計特異的上、下游引物，使用GenBank Blast同源性檢索后由Invitrogen公司(上海)合成。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin的引物序列及參數見表1。在30 μL體系中進行擴增：10 μL總RNA，1 μL M-MLV反轉錄酶，1 μL RNA酶抑制劑，4 μL dNTP，2 μL Oligo dT，4 μL DTT和8 μL 5×buffer。42 ℃，反應30 min，99 ℃滅活5 min，5 ℃ 5 min。RT產物瞬時離心，立即使用或保存在-20 ℃備用。上述各項指標的測定重復3個不同批次的細胞，每批細胞每個樣本重復3次，數據以平均值±標準差表示。

1.5 數據統計分析

應用SPSS13.0軟件對數據進行顯著性檢驗。采用REST軟件分析毒素處理樣品各目的基因mRNA表達豐度的差異并計算。

2 結果與分析

2.1 DON、ZEA聯合染毒對雞脾臟淋巴細胞培養上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影響

DON、ZEA聯合染毒對上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影響，見表2。由表2可見，染毒48 h，隨毒素濃度的升高，雞脾臟淋巴細胞上清液中IL-10和IFN-γ蛋白含量均升高，蛋白含量除IL-10和IFN-γ在DZ-1組外，均顯著或極顯著高于空白對照組(P<0.01)；而隨毒素濃度的升高，IL-2和IL-4蛋白含量降低，除IL-2、IL-4在DZ-1組、IL-2在DZ-2組外，均顯著或極顯著低于空白對照組(P<0.01)。DON、ZEA聯合染毒48 h，除IL-4在DZ-3與DZ-4間，IFN-γ在DZ-2與DZ-3 (DZ-1組)間外，其余各組組間差異顯著或極顯著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯合染毒可導致雞脾臟淋巴細胞培養上清中IL-10和IFN-γ蛋白含量隨毒素濃度的升高而增加，IL-2和IL-4蛋白含量均隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關系。

表1 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin基因的引物設計

表2 DON、ZEA聯合對雞脾臟淋巴細胞上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影響

同列數據上沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

In the same column， values without the same capital letters mean that the difference is significant (P<0.01). The same as below.

2.2 DON、ZEA聯合染毒對雞脾臟淋巴細胞內IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的mRNA表達的影響

DON、ZEA聯合作用對雞脾臟淋巴細胞內IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ基因的mRNA的表達，見表3。由表3可見，DON、ZEA聯合染毒48 h，除IL-10在DZ-1組，雞脾臟淋巴細胞內IL-2、IL-4和IL-10 mRNA表達量均隨毒素濃度的升高而升高，極顯著高于空白對照組(P<0.01)；IFN-γ的mRNA表達量呈先升高后降低趨勢，但均極顯著高于空白對照組(P<0.01)。DON、ZEA聯合染毒48 h，除IL-10在DZ-1組與空白對照組間，其余各組組間差異極顯著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯合染毒可導致雞脾臟淋巴細胞內IL-2、IL-4和IL-10 mRNA表達量隨毒素濃度的升高而增加，具有顯著的劑量依賴關系；IFN-γ mRNA表達量隨毒素濃度的升高而先升高后降低。

表3 DON、ZEA聯合染毒對雞脾臟淋巴細胞調控基因IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表達

3 討論

DON、ZEA均可破壞機體免疫系統造成免疫抑制，它們作用于免疫系統的主要靶器官是脾臟。但目前它們對雞脾臟功能影響的研究主要集中在脾臟相對質量、組織病理學改變方面，對細胞因子的影響多是單獨毒素染毒的研究，而兩種毒素聯合染毒對雞脾臟淋巴細胞分泌細胞因子的影響研究較少。因此，本實驗研究DON、ZEA對雞脾淋巴細胞分泌細胞因子的影響，即Thl細胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2細胞因子(IL-4和IL-10)在體外培養的脾淋巴細胞的上清液中的分泌含量和細胞內細胞因子基因的mRNA的表達。

ZEA誘導人和小鼠的幾個免疫指標改變，即增加IL-2和IL-5的產生，并誘導免疫抑制作用[13-15]。ZEA誘導老年鼠分泌的IFN-γ減少[16]。范小龍等[17]采用ELISA的方法測定ZEA對離體培養的小鼠淋巴細胞因子IFN-γ和1L-10分泌的影響，結果表明低濃度ZEA(1 μg·mL-1)能顯著促進脾臟淋巴細胞分泌IL-l0，而高濃度ZEA(10、25 μg·mL-1)能極顯著抑制脾臟淋巴細胞分泌lL-10，不同濃度ZEA均能顯著或極顯著抑制脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ。本實驗結果與上述結果部分類似，但因不同動物對DON、ZEA的敏感性存在種屬差異。所以，目前研究結果與以往的研究結果可能也會有差異。

目前單一DON或ZEA對細胞因子的影響報道較多見，而DON和ZEA聯合染毒對細胞因子影響的報道較少見。Ren等[18-19]分別報道了DON和ZEA聯合染毒可降低小鼠血清IL-4和IFN-γ的濃度。在我們的實驗中，隨著DON和ZEA聯合毒素濃度的增加，雞脾臟淋巴細胞分泌的IL-4的濃度和mRNA的表達量都是下降的；細胞分泌的IFN-γ的濃度雖然升高，但mRNA的表達量先升高后下降，預測試驗時間延長后濃度也會下降。總體上，DON和ZEA聯合染毒對雞脾臟淋巴細胞分泌細胞因子的影響和Ren等[18-19]報道的DON和ZEA聯合染毒對小鼠血清細胞因子影響的趨勢相一致。

本實驗結果表明，DON、ZEA聯合染毒雞脾淋巴細胞上調或下降促炎性細胞因子的水平。Th1和Th2細胞因子平衡失調，因此造成細胞免疫損傷，進而產生毒性。