ERF3促根突變體緩解高濃度CO2對粳稻植株氮吸收的負效應

王偉露 ，袁嫚嫚 ，朱建國，劉鋼

1. 中國科學院南京土壤研究所/土壤與可持續農業國家重點實驗室，江蘇 南京 210008；2. 中國科學院大學，北京 100049

大氣CO2濃度持續升高，提高了水稻光合能力，有利于增加地上部干物質積累和產量（Kimball，2016；李春華等，2016）。早先FACE（free air CO2enrichment）研究表明，水稻產量對高濃度 CO2的響應程度依賴品種選擇和氮水平（Kim et al.，2003；Hasegawa et al.，2013；Yang et al.，2006）。高 CO2濃度條件下，粳稻增產幅度較低，約為10%～15%，是雜交秈稻品種增幅的一半。隨著氮水平的增加，粳稻產量對高濃度CO2的響應有所增強（Kim et al.，2003；Yang et al.，2006）。因此，增施氮肥以增強粳稻品種產量對高濃度CO2的響應十分重要。然而，氮肥過量使用會對環境造成諸多負面效應（Peng，2011）。因此，如何在控制氮肥使用量的前提下，進一步提高粳稻產量對高濃度CO2的響應能力，具有重要意義。

前期研究表明，制約粳稻對高濃度 CO2的響應能力的關鍵在于葉片凈光合速率及每穗穎花數的穩定響應（Zhu et al.，2014）。葉片凈光合速率和每穗穎花數的發育和建成均受到氮濃度的調控（Chen et al.，2014；Ding et al.，2014）。然而，高濃度 CO2明顯降低了水稻各器官的氮濃度（Terashima et al.，2014）。高濃度CO2條件下各器官氮濃度下降的主要原因包括：（1）生物量增加導致的稀釋效應（Gifford et al.，2000）；（2）蒸騰下降導致氮素吸收下降（Drake et al.，1997）；（3）CO2濃度升高導致植物對氮素的需求降低（Li et al.，2003）；（4）CO2濃度升高導致的氮素損失（Pang et al.，2006）。Feng et al.（2015）研究表明，高濃度 CO2下氮濃度在沒有生物量稀釋的情況下，氮濃度依然降低，表明氮濃度下降可能還與植物對氮的吸收密切相關。Finzi et al.（2007）研究表明，在未來全球大氣 CO2升高的背景下，增強植物對氮素的吸收相較于提高氮素利用效率更為重要。這表明提高粳稻氮吸收可能可以緩解高濃度 CO2對氮濃度的負效應，是提高粳稻產量對 CO2升高的響應能力的重要途徑。

植物氮吸收與根系的形態結構及根系的功能密切相關（Peng，2011）。前人研究表明，高濃度CO2下，粳稻根系生物量顯著增加，但其單位根干重的根系活力在拔節后顯著下降（Yang et al.，2008）。龐靜等（2005）指出 FACE條件下，粳稻單莖的根系活力下降，且無機氮含量呈下降趨勢，這說明根系活力同氮素的吸收存在內在的聯系。增施氮肥可以提高水稻根系活力，同時根系活力的增加可促進氮素吸收，提高葉片凈光合速率、籽粒灌漿強度、結實率等（王余龍等，1992；葉寶興等，2005；戢林等，2012；陳云風，2015）。通過增強根系活力促進氮的吸收能力能否緩解高濃度 CO2下氮濃度降低的現象目前仍為未知。

乙烯響應因子家族（ERF）是一類調節植物生長發育和脅迫響應的轉錄因子。早先的研究多集中于 ERF在生物以及非生物脅迫方面的調節作用（Xu et al.，2008；Zhang et al.，2013）。近年來，對ERF響應因子的研究發現了其更多新的功能。Zhao et al.（2015）研究表明，OsERF3過表達植株產生更大的根系統，形成更多冠根，主根變長。理論上ERF3過表達株系單莖根系活力會有所提高。為了探究高濃度 CO2下根系形態的增大及其活力的增強是否有利于緩解大氣 CO2濃度升高對粳稻氮吸收的負效應，本研究利用生長箱和 FACE平臺，以促根突變體ERF3及其野生型為研究對象，考察二者根系形態及活力、組織氮濃度、氮素吸收和利用效率、葉片凈光合速率、地上部生物量對CO2濃度升高的響應，以期為進一步提高粳稻物質生產和產量響應幅度提供理論依據。本研究假設：（1）促根突變體ERF3可以提高根系活力；（2）ERF3突變體在高濃度 CO2下可以提高植株氮吸收，避免組織氮濃度的下降；（3）ERF3突變體可以提高粳稻葉片凈光合速率和物質生產對高 CO2濃度的響應幅度。

1 材料與方法

1.1 供試材料和培養條件

水稻品種中花11（粳稻）為野生型供試品種，OsERF3突變體以中花11為遺傳背景（Zhao et al.，2015）。

試驗A于2016年4月在中國科學院南京土壤所生長箱進行，對照和 CO2處理分別設置為 400 μmol·mol-1和 600 μmol·mol-1。于 4 月 3 日先用 H2O2將水稻種子消毒30 min后浸種，催芽2～3 d后用1/2濃度的培養液育秧12 d后移栽至7 LPVC面包盒中進行試驗處理28 d。營養液采用國際水稻所的配方配制（略做修改）：1.25 mmol·L-1NH4NO3，0.3 mmol·L-1KH2PO4，0.35 mmol·L-1K2SO4，1 mmol·L-1CaCl2·2H2O，1 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.5 mmol·L-1Na2SiO3·9H2O ， 9 μmol·L-1MnCl2·4H2O ， 0.39 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O，20 μmol·L-1H3BO3，0.37 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.32 μmol·L-1CuSO4·5H2O，20 μmol·L-1FeSO4·7H2O+Na2-EDTA。每天用 NaOH調節pH為5.5。兩個生長箱相對濕度為70%左右，晝夜溫度分別為 29 ℃和 21 ℃，光合有效輻射（PAR）為 800～1000 μmol·m-2·s-1。

試驗 B于江蘇省江都市小紀鎮馬凌村良種場（119°42′0″E，32°35′5″N）進行，該地區年降雨量約1000 mm，年均溫約 15 ℃，年均日照時間大于2000 h。平臺共有3個 FACE試驗圈和3個對照（Ambient）圈。FACE圈之間以及FACE圈與對照圈之間的間隔大于90 m，以減少CO2擇放對其他圈的影響。FACE圈設計為正八角形，直徑12 m，平臺運行時通過 FACE圈周圍的管道向中心噴射純CO2氣體，利用計算機網絡對平臺的CO2擇濃度進行監測和控制，根據大氣中CO2濃度、風向、風速、作物冠層高度的CO2濃度及其晝夜變化等因素自動調節CO2氣體的釋放速度及方向，使水稻主要生育時期FACE圈內CO2濃度保持比大氣背景CO2濃度高 200 μmol·mol-1。對照田塊沒有安裝 FACE 管道，其他環境條件與自然狀態一致（Yang et al.，2006）。采用盆栽試驗，于2016年稻季開展，5月25日播種大田育秧，6月20日移栽至盆栽中。每盆3穴，每穴2苗。盆缽上下長、寬分別為20 cm和10 cm，高30 cm，每盆裝風干土6.5 kg。土壤質地為沙壤土，氮肥按照大田 250 kg·hm-2純氮施用，基肥∶分蘗肥∶穗肥比例為 4∶3∶3。其中，基肥為每盆 1.54 g尿素（46% N）、無水磷酸二氫鈉1.31 g（26% P），氯化鉀0.5 g（52% K）。分蘗肥和穗肥分別于移栽后7 d和倒3.5葉期（抽穗前31 d）一次性水溶施入，共處理 24盆。適時進行病蟲草害防治，保證水稻正常生長發育。

1.2 取樣和測定

1.2.1 樣品采集

試驗A和試驗B盆栽分別于處理后28 d，拔節后15 d采樣。其中試驗A取植株根系用于形態結構考察，而后與地上部樣本在 80 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎機研磨。選取部分鮮樣于液氮中速凍后轉移至-80 ℃冰箱，用于根系活力的測定。試驗 B地上部和根系樣本在 80 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎機研磨。

1.2.2 根系指標測定

考察試驗A中根系冠根數及扎根深度。采用根系掃描儀（WinRHIZO；Regent Instruments Inc.，Quebec，ON，Canada）分析根系長度。根系活力采用α-萘胺法測定（李合生，2000），略做修改。稱取1 g新鮮根樣，轉入150 mL 含有20 mg·L-1α-萘胺的三角瓶中。將三角瓶置于搖床上，在室溫條件下孵育3 h。過濾，吸取2 mL濾液，加入1 mL亞硝酸鈉（NaNO2，1.18 mmol·L-1）和 1 mL 對氨基苯磺酸混勻。用分光光度計測定510 nm吸光度值。余下的根系樣本在70 ℃烘干至恒質量。以單位根干質量α-萘胺的氧化量表征根系活力，單位為 μg·g-1·h-1。

1.2.3 光合參數測定

試驗B盆栽試驗于取樣前，釆用Li-Cor 6400光合測定系統測定新完全展開葉的凈光合速率（A）。測定時間為 09:30—15:00，對照和處理 CO2濃度分別設置為 390 μmol·mol-1和 590 μmol·mol-1。測定光強設定為 1800 μmol·m-2·s-1，流量為 500 mL·s-1，葉室溫度為(30±2) ℃，相對濕度維持在 60%左右。測定后的葉片用液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存，用于測定 1, 5-二磷酸加氧/羧化酶（Rubisco）。

1.2.4 氮素和Rubisco含量測定

烘干的植株樣本研磨粉碎后經濃 H2SO4-H2O2消煮，用全自動定氮儀測定樣本氮含量。葉片中Rubisco含量的測定參照Li et al.（2013）方法。取0.5 g葉片加液氮并迅速研磨成粉狀，加入5 mL提取液[50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），5 mmol·L-1β-mercaptoethano和12.5%（V/V）glycerol]勻漿，后在1500 g、4 ℃條件下離心15 min。上清液與2%（W/V）SDS、4%（V/V）β-mercaptoethanol和 10%（V/V）glycerol溶液混合，在沸水中煮 5 min。SDS-PAGE凝膠電泳參照Li et al.（2013），電泳后，凝膠用0.25%考馬斯亮藍染色12 h，脫色。切除含有大亞基和小亞基的凝膠，轉移至10 mL含有2 mL甲酰胺的試管中，50 ℃水浴8 h。用分光光度計測定595 nm處吸光值。

地上部生物量生產效率（NUEb，mg·mg-1）為地上部生物量與地上部氮素總吸收量之比。

1.3 數據處理

運用Microsoft Excel軟件整理數據，SPSS 19.0軟件進行一般線性模型（GLM）多因素方差分析，樣本間差異采用最小顯著差數法（Least significant difference test），顯著性水平設置為 α=0.05。運用SigmaPlot 12.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 突變體和野生型粳稻根系的形態及生物量對高濃度CO2響應特征

如圖1所示，生長箱對照條件下，野生型和突變體總根長無顯著差異（P＞0.05）。突變體冠根數和扎根深度略高于野生型，增幅分別為7.6和5.3%，未達顯著水平（P＞0.05）。在高濃度 CO2下，野生型總根長、冠根數以及扎根深度分別顯著增加86.4%、35.9%和35.9%，突變體ERF3總根長、冠根數以及扎根深度分別顯著（P＜0.05）增加124.0%、79.7%和 42.3%，這表明 ERF3根系形態對高濃度CO2的響應能力更強。由圖2可知，對照條件下，生長箱和田間盆栽中ERF3突變體根系生物量與野生型無顯著差異（P＞0.05）。在高濃度 CO2下，生育前期（生長箱）突變體ERF3根系生物量的增幅大于野生型，生育后期（田間盆栽）ERF3和野生型根系生物量增幅相似。

圖1 生長箱中CO2濃度升高對野生型和突變體根系形態指標的影響Fig. 1 Root morphology parameters of wild type (WT) and ERF3 mutant under elevated CO2 in growth chamberA：對照；E：CO2+200 μmol·mol-1。WT：野生型；ERF3為 OsERF3突變體。樣品重復數n=3。不同字母表示在0.05水平上差異顯著。下同A, ambient; E, elevated CO2 treatment (+200 μmol·mol-1). WT, wild type; ERF3, OsERF3 mutant. n=3. Different letters indicate significant difference at P＜0.05. The same as below

2.2 突變體和野生型根系活力對高濃度CO2的響應

由圖3可知，生長箱對照條件下，突變體單莖根系活力同野生型相比無顯著變化（P＞0.05）。但是，高濃度CO2條件下，突變體ERF3單莖根系活力顯著（P＜0.05）提高212.1%，野生型根系活力僅增加16.6%。

2.3 突變體和野生型地上部生物量對高濃度 CO2的響應

由圖4A可知，生長箱對照條件下，ERF3突變體地上部生物量略高于野生型。野生型和突變體ERF3地上部生物量對高濃度CO2的響應顯著增加（P＜0.05），分別為65.1%和156.9%。如圖4B所示，田間盆栽對照條件下，野生型和突變體地上部生物量無顯著差異（P＞0.05）。高濃度 CO2顯著（P＜0.05）增加野生型和突變體中莖稈生物量，分別增加32.1%和57.7%。突變體ERF3葉片生物量顯著增加（P＜0.05）。

2.4 突變體和野生型組織氮濃度對高濃度 CO2的響應

圖3 生長箱CO2濃度升高對野生型和突變體根系活力的影響Fig. 3 Amount of a-NA per culm of wild type (WT) and ERF3 mutant under elevated CO2 in growth chamber

由圖5可知，生長箱對照條件下，野生型地上部氮濃度顯著（P＜0.05）高于促根突變體 ERF3，這與田間盆栽試驗結果類似。高濃度CO2下，生長箱中野生型地上部氮濃度顯著（P＜0.05）降低16.4%，突變體則無顯著變化（P＞0.05）。田間盆栽結果表明，野生型葉片氮濃度顯著（P＜0.05）降低16.9%，莖稈氮濃度亦有降低趨勢但未達顯著水平（P＞0.05）。突變體ERF3則表現為葉片氮濃度顯著（P＜0.05）增加11.7%，莖稈中氮濃度也有增加的趨勢，但未達顯著水平（P＞0.05）。

圖2 生長箱（A）和田間盆栽（B）CO2濃度升高對野生型和突變體根系生物量對的影響Fig. 2 Root biomass (dry) of wild (WT) and ERF3 mutant under elevated CO2 in growth chamber (A) and field (B)

圖4 生長箱（A）和田間盆栽（B）CO2濃度升高對野生型和突變體地上部生物量的影響Fig. 4 Shoot dry matter of wild type (WT) and ERF3 mutant under elevated CO2 in growth chamber (A) and field (B)

圖5 生長箱（A）和田間盆栽（B，C）CO2濃度升高對野生型和突變體各組織氮質量分數的影響Fig. 5 Nitrogen concentration of wild type (WT) and ERF3 mutant under elevated CO2 in growth chamber (A) and field (B, C)

2.5 突變體和野生型氮素吸收對高濃度CO2的響應

從圖6A可知，生長箱對照條件下，野生型和突變體氮素累積無顯著差異（P＞0.05）。高濃度CO2分別顯著（P＜0.05）提高了野生型和突變體 ERF3氮吸收量，增幅分別為40.6%和113.5%。由圖6B可知，田間盆栽對照條件下，突變體ERF3地上部氮素累積顯著（P＜0.05）低于野生型，主要歸因于葉片中氮素累積的降低。CO2濃度升高顯著（P＜0.05）增加了突變體葉片和莖稈中氮素累積量，分別達23.8%和77.0%。

2.6 突變體和野生型氮素利用效率對高濃度 CO2的響應

從圖7A可知，生長箱中野生型和突變體氮素干物質生產效率分別增加16.7%和21.3%，僅突變體增幅達顯著水平（P＜0.05）。由圖7B可知，田間盆栽試驗，野生型氮素干物質生產效率顯著（P＜0.05）增加20.3%，而突變體ERF3氮素生物量利用率則未發生顯著變化（P＞0.05）。

2.7 突變體和野生型葉片光合參數對高濃度 CO2的響應

從圖8A可知，對照條件下，野生型和突變體葉片凈光合速率無顯著差異（P＞0.05）。FACE條件下，野生型和突變體ERF3葉片凈光合速率均顯著（P＜0.05）增加，增幅分別為13.3%和42.8%。由圖8B可知，野生型光合關鍵酶 Rubisco含量顯著（P＜0.05）降低24.8%，突變體ERF3則未發生顯著（P＞0.05）變化。

3 討論

圖6 生長箱（A）和田間盆栽（B）CO2濃度升高對野生型和突變體各組織氮吸收的影響Fig. 6 Nitrogen uptake of wild type (WT) and ERF3 mutant under elevated CO2 in growth chamber (A) and field (B)

圖7 生長箱（A）和田間盆栽（B）CO2濃度升高對野生型和突變體地上部氮素干物質生產效率（NUEb）的影響Fig. 7 Nitrogen use efficiency (NUEb) of wild type (WT) and ERF3 mutant under elevated CO2 in growth chamber (A) and field (B)

圖8 大田盆栽野生型和突變體葉片凈光合速率對CO2濃度升高的響應Fig. 8 Leaf net photosynthesis rate of wild type (WT) and ERF3 mutant in FACE site

水稻擁有復雜的根系統，主要由主胚根、側根和不定根組成（Yoshida，1981）。根系的形態結構與植物對養分的吸收、干物質生產及產量密切相關（Zhang et al.，2009；楊建昌，2011）。前人研究表明，從分蘗盛期開始，大氣CO2濃度升高顯著增加粳稻總根長、冠根數、根系體積及根系生物量（Kim et al.，2003；陳改蘋等，2006；Yang et al.，2008），這是粳稻物質生產和產量在高CO2濃度下顯著提高的原因之一。本研究結果表明，高 CO2濃度顯著（P＜0.05）增加野生型和突變體總根長、冠根數、扎根深度及根系生物量，這與前人的研究結果一致。此外，突變體ERF3根系形態各指標和根系生物量對高 CO2濃度的響應強度高于野生型，約高出6.4%～191.0%。這表明，高CO2濃度條件下，突變體ERF3根系形態結構較野生型具有更明顯的增幅潛力。前人認為地上部和根系的生長對碳水化合物的需求是競爭的關系，活躍的地上部生長可為根系的形態建成和發育提供充足的碳水化合物；根系的活躍生長也可為地上部提供充足的養分（Zhang et al.，2009）。因此，根系生物量的增加與地上部生物量對高CO2濃度的響應存在密切的關系。然而，根系生物量的形成所消耗的碳水化合物約為地上部的2倍，過大的根系會抑制地上部的生長，反過來阻礙根系的生長和發育。這可以解釋為什么在試驗初期（育秧時期），ERF3在對照條件下發根能力（根長和冠根數）強于野生型，而隨著生育期的推進，ERF3與野生型之間根系形態參數的差異逐漸縮小，即促根生長消耗了過多的碳水化合物。

根系氧化能力被認為是表征根系生理活性的重要參數（Yang et al.，2004）。較高的根系活力對于維持根系生物量、根系生長和養分吸收非常重要（Zhang et al.，2009；戢林等，2012；陳云風，2015）。根系活力的強弱多以單位時間內單位根干重對 α-萘胺的氧化量表征，而后者與根系過氧化氫酶的氧化能力有關。根系和地上部充足的碳水化合物一方面為過氧化氫酶的合成提供充足的碳骨架，另一方面為過氧化氫酶的氧化過程提供所需的能量物質ATP。前人研究結果表明，高CO2濃度降低了粳稻單莖根系活力（龐靜等，2005；Yang et al.，2008）。本研究并未在野生型結果中發現類似的現象，這可能是由于水培試驗周期較短，根系和地上部生物量對高CO2濃度的響應依然較高。突變體ERF3根系和地上部生物量優勢明顯是其單莖根系活力對高CO2濃度的響應能力強于野生型的重要原因。

前人研究結果均表明，高CO2濃度降低了粳稻各器官氮濃度（Kimball，2016），這與本研究結果一致。氮濃度的下降減緩了粳稻物質生產和產量對高CO2濃度的進一步響應（Easlon et al.，2013）。前人針對水稻植株組織氮濃度降低這一現象提出了不同的假設，如稀釋效應，氮需求下降，氮素吸收能力降低（Drake et al.，1997；Gifford et al.，2000；Li et al.，2003）。Finzi et al.（2007）指出在氮素供應充足的條件下氮素的利用率增加，降低了植物對氮素的需求。Feng et al.（2015）采用薈萃分析指出氮素的吸收才是作物氮濃度下降的主要原因。植物對氮素的吸收不僅與根系形態有關，而且與根系活力密切相關（Kiba et al.，2016）。當根氧化力增大時，根的有氧呼吸較旺盛，吸收養分也較多（Zhang et al.，2009；楊建昌，2011）。中國FACE平臺早先的研究結果表明，在氮肥供應充足的情況下，盡管粳稻總根長、冠根數以及根系生物量顯著增加，但是單莖根系活力（活躍吸收面積以及 α-萘胺氧化量）顯著降低（龐靜等，2005；Yang et al.，2008），這導致了粳稻后期氮素吸收能力的降低。本研究結果表明，高CO2濃度條件下，促根突變體ERF3根系形態和單莖根系活力均顯著增加（P＜0.05），增幅高于野生型。突變體ERF3根系活力對高CO2濃度的響應較野生型具有更明顯的優勢。這一根系特性使得突變體ERF3在生長箱和田間盆栽試驗中的氮素吸收較野生型顯著增加（P＜0.05），并且ERF3在生長箱中的氮素利用效率對高CO2濃度的響應能力高于野生型，從而避免了各器官氮濃度的降低。這表明大根系以及根系活力增強的突變體ERF3確實可以緩解高CO2濃度對粳稻氮吸收的負效應。

眾所周知，高CO2濃度顯著提高水稻葉片凈光合速率和物質生產，這與本試驗結果一致（Chen et al.，2014）。然而，粳稻在生育后期葉片凈光合速率對高濃度CO2的響應幅度的降低制約了干物質和產量的進一步提高（Zhu et al.，2014；Kimball，2016）。水稻葉片凈光合速率同氮素存在密切關系，尤其是光合關鍵酶Rubisco（Chen et al.，2014）。在本試驗中，促根突變體ERF3較高的氮素吸收和分配使得葉片Rubisco含量保持穩定，這確保了葉片凈光合速率和地上部生物量對高濃度CO2的持續高響應。有研究指出，氮素同細胞分裂素協作調控著葉片發育和光合特性（Kurakawa et al.，2007）。外施細胞分裂素可以提高氮素向光合關鍵酶 Rubisco的分配（Ookawa et al.，2004），根系是細胞分裂素合成的主要器官。因此，高CO2濃度條件下促根突變體ERF3細胞分裂素與氮素在調節葉片凈光合速率響應能力的作用方面還有待進一步研究。此外，粳稻氮素營養狀況的改善也可能有助于緩解每穗穎花數的下降，提高稻米中蛋白質的含量，改善稻米營養品質。以上結果表明，高濃度CO2條件下，突變體ERF3較大的根系和增強的根系活力可以緩解粳稻氮吸收的負效應，有利于進一步提高粳稻物質生產對高濃度CO2的響應幅度。

4 結論

高濃度CO2條件下促根突變體ERF3大根系和根系活力增強的特性，促進了根系對氮素的吸收，避免地上部器官中氮濃度的降低。充足的氮素吸收，維持了突變體ERF3葉片氮素和Rubisco的含量，從而提高葉片凈光合速率和物質生產的響應能力。在未來的育種中，可以考慮通過促根增強粳稻對未來氣候變化的適應能力。