淺談快速檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

◎ 李昊翔

（閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 龍巖 364000）

近些年來(lái)，食品安全問(wèn)題逐漸加重，加強(qiáng)食品檢測(cè)已迫在眉睫。傳統(tǒng)的食品檢測(cè)方法以瓊脂平板培養(yǎng)法、顯微鏡鏡檢法為主，雖可檢出微生物，但效率卻很低。以色譜法、免疫學(xué)檢測(cè)法為代表的快速檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺陷。可見(jiàn)，為提高食品微生物檢測(cè)效率，對(duì)快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用效果進(jìn)行分析較為必要。

1 快速檢測(cè)技術(shù)類型及其優(yōu)勢(shì)

1.1 色譜法

色譜法為食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)的一種，包括氣相色譜法與液相色譜法兩種。由液相色譜法所衍生的高效液相色譜法可借助高壓輸液泵將具有不同極性的溶劑以一定的比例加入到色譜柱中，在此基礎(chǔ)上，將流動(dòng)相帶入至色譜柱，使兩種溶液在色譜柱中相互反應(yīng)[1]，進(jìn)而根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，獲取檢測(cè)數(shù)據(jù)。與傳統(tǒng)液相色譜法和氣相色譜法相比，將高效液相色譜法應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)過(guò)程中，可能夠有效提高檢測(cè)速度，提高檢測(cè)結(jié)果的精確度。

1.2 免疫學(xué)檢測(cè)法

用于食品微生物檢測(cè)的免疫學(xué)檢測(cè)法包括酶免疫檢測(cè)法、免疫層析法、免疫熒光法等多種。其中，酶免疫檢測(cè)法包括均向與非均相兩種，后者較為常用。酶聯(lián)免疫吸附法為酶免疫檢測(cè)法的一種[2]。理論上，具有生物活性的物質(zhì)均具有特異性抗體，如以抗原及抗體之間的特異反應(yīng)為基礎(chǔ)，對(duì)微量元素以及發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，將能夠有效測(cè)定出生物活性物質(zhì)的微量指標(biāo)。將該方法應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)過(guò)程中，可使食品中的特定微生物被有效標(biāo)記。根據(jù)標(biāo)記結(jié)果，既可判斷出食品中的微生物類型及含量。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè)法

PCR技術(shù)與基因芯片技術(shù)為生物分子技術(shù)中的兩大代表性技術(shù)。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR）為例，該技術(shù)模仿DNA的天然復(fù)制過(guò)程，對(duì)不同物質(zhì)中的微生物進(jìn)行測(cè)量。采用該方法檢測(cè)，首先需對(duì)DNA進(jìn)行變性，使其形成單鏈DNA[3]。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)退火、延伸等過(guò)程，既可得到最終的檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)前，部分PCR擴(kuò)增區(qū)較短。因此，Taq酶的活性，對(duì)DNA復(fù)制時(shí)間的影響較為有限。將PCR技術(shù)，應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)過(guò)程中，同樣能夠使檢測(cè)效率得以提升。與傳統(tǒng)的鏡檢法相比，優(yōu)勢(shì)顯著。

2 高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中阿維菌素的含量

2.1 材料與方法

2.1.1 儀器與試劑

（1）儀器。高效液相色譜儀，電子天平，離心機(jī)。

（2）試劑。阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品、儲(chǔ)備液、衍生化試劑等。其中，阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，含量為96%。儲(chǔ)備液需以標(biāo)準(zhǔn)品為準(zhǔn)，采用乙腈將其溶解，并定容至100 mL制備而成。實(shí)驗(yàn)所用衍生化試劑，均需現(xiàn)場(chǎng)配制。乙腈、甲醇為色譜純，無(wú)水硫酸鈉為分析純。

2.1.2 樣本與色譜條件

（1）樣本。本實(shí)驗(yàn)所用水產(chǎn)品樣本來(lái)源于國(guó)內(nèi)某實(shí)驗(yàn)場(chǎng)，樣本類型為草魚及對(duì)蝦。入選樣本均為健康成年水生物。

（2）色譜條件。色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水，體積比為98∶2；檢測(cè)儀器：熒光檢測(cè)器為主。

（3）檢測(cè)參數(shù)：采用熒光檢測(cè)器，波長(zhǎng)為475 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為室溫。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，利用乙腈將溶液的濃度分別稀釋為1、10、50、100 μg/L。取不同濃度的溶液0.5 mL加入至離心管中，取衍生化試劑衍生化15 min。將甲醇加入至衍生化后的溶液中，定容為1 mL。使甲醇與溶液相互反應(yīng)40 min后停止。采用HPLC-FD對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到最終方程，判斷各項(xiàng)參數(shù)是否符合線性關(guān)系。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 色譜圖及線性關(guān)系

當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為10 μg/L時(shí)，可見(jiàn)色譜基線基本平穩(wěn)。通過(guò)對(duì)阿維菌素保留時(shí)間的觀察，發(fā)現(xiàn)平均時(shí)間約為7.9 min。進(jìn)一步觀察線性關(guān)系曲線發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阿維菌素的使用量，為1.0～100.0 μg/L時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=1293.001x+12.487，r=0.9999。

進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，阿維菌素的回收率處于75%以上，峰面積最高為15%。當(dāng)加標(biāo)量為0.1 μg/kg時(shí)，回收率、信噪比及峰面積均達(dá)到了極限值。因此，可視0.1 μg/kg 為檢測(cè)限。

2.2.2 回收率與精密度

兩種水產(chǎn)品檢測(cè)回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表1與表2。

表1 草魚檢測(cè)回收率及精密度表

表2 對(duì)蝦檢測(cè)回收率及精密度表

2.2.3 檢測(cè)結(jié)果

①采用高效液相色譜法，對(duì)空白樣品中的阿維菌素含量進(jìn)行檢驗(yàn)，未檢出樣品中含有阿維菌素。②采用采用高效液相色譜法檢驗(yàn)濃度為1 μg/L的樣品，檢驗(yàn)結(jié)果為0.98 μg/L。③采用該方法檢驗(yàn)濃度為10、50、100 μg/L的樣品，檢驗(yàn)結(jié)果分別為9.94、49.87、99.96 μg/L。上述檢驗(yàn)結(jié)果表明，將高效液相色譜法應(yīng)用到水產(chǎn)品阿維菌素檢驗(yàn)過(guò)程中，檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度較高，與實(shí)際結(jié)果差異極小，可予以忽略。

2.3 提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的途徑

2.3.1 嚴(yán)格控制試劑類型

采用高效液相色譜法檢驗(yàn)草魚與對(duì)蝦兩種水產(chǎn)品中阿維菌素的濃度，檢測(cè)結(jié)果受標(biāo)準(zhǔn)溶液溶劑類型的影響較大。將甲醇作為主要試劑與衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)，雖能夠檢出微生物含量，但受吹干等處理過(guò)程的影響，部分待測(cè)物可能存在損失[4-5]。因此，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度一般不高。如將乙腈作為主要試劑，應(yīng)用到微生物檢測(cè)過(guò)程中，將可有效省略吹干的過(guò)程，減少待測(cè)物損失。進(jìn)而使檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，能夠得到進(jìn)一步的提升。

2.3.2 嚴(yán)格控制提取條件

采用高效液相色譜法，檢驗(yàn)草魚與對(duì)蝦兩種水產(chǎn)品中阿維菌素的濃度，如取0.5 g肌肉進(jìn)行檢測(cè)，將乙腈溶液量控制為15 mL，僅需重復(fù)檢測(cè)2次，既可得到最終結(jié)果。但由于SPE柱吸附活性差，因此凈化效果較差。如將無(wú)水硫酸鈉，應(yīng)用到檢測(cè)過(guò)程中。將能夠有效改善凈化效果，脫去提取液中的水分，提高測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

采用快速檢測(cè)技術(shù)中的色譜技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品中的阿維菌素進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，與傳統(tǒng)的鏡檢法相比優(yōu)勢(shì)顯著。對(duì)此，我國(guó)食品安全衛(wèi)生領(lǐng)域應(yīng)將以色譜法為代表的各項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)過(guò)程中，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題食品，及時(shí)對(duì)其進(jìn)行整治，使我國(guó)的食品安全問(wèn)題得到解決。