一個LIG4綜合征家系基因突變分析和產前診斷

張鑫麗 沈國松 李雯雯 陽鑫妙

嚴重聯合免疫缺陷病（severe combined immunodeficiency，SCID）是一組有不同基因異常所致的嚴重T細胞缺乏或功能異常，并伴隨B淋巴細胞功能異常的疾病[1]。SCID是一類比較多見的原發性免疫缺陷病，新生兒的發病率為1/75 000～1/100 000[2]。目前發現的SCID相關基因有 13 個，包括 IL-2RG、ADA、JAK3、RAG1、RAG2、IL-TRa、DCLRE1C、LIG4、DNA-PKcs、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD45[3]。其中LIG4基因突變引起的SCID稱為LIG4綜合征，這是一種非常罕見的常染色體隱性遺傳病，患兒常表現為發育異常和腫瘤傾向[4]。LIG4綜合征是嚴重的致死性遺傳病，藥物治療效果差，早期基因診斷行免疫重建是治療和延長已出生患兒生存期的最好辦法。但是，預防患兒出生是最終目標。因此，本研究通過應用芯片捕獲后行高通量測序法檢出先證者的基因突變，成功對其母親再次妊娠進行產前診斷，有效避免患兒的出生；現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者女，足月順產出生，頭圍偏小，體重偏輕。1歲時因接種疫苗后開始持續有中耳炎、腹瀉、巨細胞病毒感染，血常規檢查提示全血細胞減少，對抗生素和免疫球蛋白的治療效果差，一直轉輾于本院與外院治療。當時先證者及其父母均抽取外周血作基因檢測。先證者3歲時因顱內腫瘤死亡。父母表型正?！，F母親再次懷孕（高齡并孕20周），為避免再次分娩LIG4綜合征患兒，2016年11月8日來本院作產前診斷。

1.2 目標序列捕獲 抽取先證者及其父母外周靜脈血5ml，標準流程提取基因組DNA（QIAamp DNA Blood Midi Kit，德國Qiagen）。質檢合格的基因組DNA使用Covaris LE220超聲波儀（美國Massachusetts）進行隨機打斷，產生200～250bp的隨機片段。隨后進行Ampure Beads純化，將純化后的DNA片段進行末端修復、加“A”以及加接頭反應，再經過連接介導PCR（ligationmediated PCR，LM-PCR）進行擴增和純化。利用定制的1445號基因片段捕獲芯片（Roche Nimble Gen，美國Madison）與20個標記好的患者DNA庫47℃雜交64～72h，通過芯片雜交捕獲下來的DNA片段用鏈霉親和素磁珠富集，被捕獲的片段使用LM-PCR生成測序用的DNA庫。

1.3 序列分析 首先對生成的測序DNA庫進行質檢，去除低質量以及被接頭污染的測序序列。合格的DNA庫與Illumina測序原件上的互補接頭進行雜交，然后使用高保真的DNA聚合酶對其進行擴增，在HiSeq 2000測序平臺上進行高通量測序。測序深度＞100X，測序數據分析采用Illumina分析流程。使用Illumina basecalling 1.7軟件進行原始圖像數據處理。每條測序序列產生90bp的雙向測序讀長。

1.4 Sanger法驗證 對所有發現的致病突變，在其所在片段上下游設計引物。行PCR擴增，對產物作Sanger測序，所得結果與LIG4基因標準序列進行比對，從而驗證基因芯片捕獲和高通量測序的結果。

1.5 羊水母血污染鑒定和產前診斷 對先證者母親在超聲引導下經腹行羊膜腔穿刺術抽取羊水20ml，其中10ml按標準流程提取基因組DNA后，選用16HS System試劑盒（Promega Corporation，美國Madison）、ABI3130XL遺傳分析儀，與父母DNA進行個體識別和親子鑒定。確定無母源污染后，再對羊水DNA的LIG4基因作針對性的Sanger法驗證；另外10ml羊水用于常規細胞培養、制片及G顯帶核型分析。

2 結果

2.1 LIG4基因突變的確定 高通量測序顯示先證者攜帶LIG4基因的復合雜合突變，位點為c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs），見圖1。其中父親攜帶c.833G＞C（p.A278L），是錯義突變；母親攜帶1271-1275del（p.K424fs），是框移突變。2個位點為已證實的突變，故本研究未在健康群體中驗證。

圖1 先證者LIG4基因測序圖

2.2 胎兒的產前診斷 羊水DNA的LIG4基因經過Sanger驗證，顯示胎兒攜帶與先證者相同的LIG4基因突變位點，即 c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs）。胎兒的羊水染色體核型為46，XX。

2.3 遺傳咨詢 本院產前診斷中心告知該胎兒出生后將發展為LIG4綜合征患者，家屬選擇終止妊娠。

3 討論

LIG4綜合征是一種DNA雙鏈斷裂后非同源末端鏈接（non-homologous end joining，NHEJ）通路缺陷病，為罕見的常染色體隱性遺傳病，在2011版原發性免疫缺陷病分類中被歸為聯合免疫缺陷病[5]。其臨床表現為輻射敏感，小頭畸形，生長發育遲緩，聯合免疫缺陷、自身免疫性疾病和腫瘤等。LIG4綜合征的發病機制是LIG4基因異常。LIG4即DNA連接酶4，是NHEJ的核心組分之一，基因位于13q33-34。含有1個氨基端催化域和2個羧基端乳腺癌易感蛋白的LC末端結構域。LIG4和XRCC4通常以復合體的形式存在，主要參與DNA斷鏈末端的對比和缺口填補，還能與DNA斷鏈末端的DNA-Pkcs、Ku蛋白相互作用，促進DNA斷鏈的連接。LIG4在復制和V（D）J重排過程中起著重要作用。因此，當LIG4缺陷時，若細胞出現損傷會因無法正常修復而死亡；或在發生免疫反應時，T、B淋巴細胞因受體重排障礙而失去免疫功能，從而導致聯合免疫缺陷[6]。

Buck等[7]報道15例LIG4缺陷的患者中，有6例出現血液惡性腫瘤，2例為前T細胞白血病和（或）淋巴瘤，1例骨髓發育不良，4例出現B細胞增殖性疾病。而本例患兒的臨床表現與上述報道相符，其LIG4的基因測序顯示為1271-1275del（p.K424fs）的復合雜合突變。其中c.833G＞C（p.Arg278Leu）導致LIG4蛋白氨基酸（aa）序列第278位點發生密碼子改變：由精氨酸變為亮氨酸；該aa位點位于活化中心周圍的一個高度保守基因序列，其改變將導致LIG4功能明顯受損[7]。已有該位點致病性的相關報道，Jiang等[8]同時用Sift和Polyphen軟件對其蛋白功能進行預測，也認為對LIG4蛋白功能有害，該位點人群發生率極低。而1271-1275del（p.K424fs）的框移突變是已知的致病突變，它能使編碼蛋白序列提前終止，產生截短蛋白或被降解，早期終止密碼子啟動無義突變介導的mRNA降解，大大降低mRNA表達及LIG4蛋白表達，該位點人群發生率也極低。由于LIG4綜合征是一種常染色體隱性遺傳病，患兒的父母為1個突變位點的攜帶者，未見發病；患兒為同一基因的復合雜合突變，對LIG4蛋白功能的影響大，使得患兒發病。LIG4綜合征的患兒發病早、病情較重、早期致死，因此早期診斷并行造血干細胞移植是目前最有效的治療手段。國外已報道1例LIG4基因復合雜合突變（q1+H282L+R581fs）的患者免疫重建成功[9]。但是，移植成功率低、移植后并發癥多、醫療費用昂貴等限制了其臨床應用。因此，避免患兒出生是產前診斷的根本目標。該家族父母再次生育LIG4綜合征患兒的概率為1/4，且胎兒期患兒無典型的外觀異常，無法用影像學檢查來診斷，只能依靠基因測序。因此，本中心在患兒母親再次妊娠時，根據孕婦年齡、孕周行羊膜腔穿刺術抽取胎兒羊水細胞，一部分進行胎兒核型分析；同時排除母源污染后用Singer法檢測胎兒的LIG4基因，驗證胎兒攜帶與先證者相同的致病突變，告知家屬其出生后將發展成LIG4綜合征患者，家屬最終選擇終止妊娠。此外，本中心已指導該夫妻想要生育健康的胎兒，可行三代試管嬰兒，即胚胎植入前產前診斷，防止該遺傳病的傳遞。

綜上所述，本研究采用目標序列芯片捕獲SCID發病相關基因，再通過高通量測序進行LIG4基因突變檢測。芯片捕獲高通量測序技術是新一代的測序技術，相較于傳統單基因病成本高、適用疾病少、普及面低、通量低的檢測方法，它能在較短時間內同時對幾十萬甚至幾百萬條DNA分子進行序列分析，因此更適用于對單基因病隱性遺傳病攜帶者的篩查與產前診斷[10]。本次研究完成了1個LIG4綜合征家系的基因突變鑒定和再次妊娠的產前診斷，避免了高危胎兒的出生。