LRP6和VEGFR2在牦牛肺的分布

馬俊興，何俊峰，崔 燕，張 倩，劉鵬剛

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

隨著海拔的升高，空氣中的氧氣含量會(huì)逐漸減少，造成長(zhǎng)期暴露于高海拔環(huán)境中的哺乳動(dòng)物會(huì)發(fā)生高山病。而生活在海拔3 000～6 000 m 高寒地區(qū)的牦牛(Bosgrunniens)已具有適應(yīng)這種高原低氧環(huán)境的穩(wěn)定遺傳學(xué)特性[1-3]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)為低密度脂蛋白受體家族中的一員,起初發(fā)現(xiàn)它主要與脂蛋白特別是殘余乳糜微粒的清除有關(guān),它有30多種配體分子,參與體內(nèi)多種生理和病理過程[4]。通過配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究發(fā)現(xiàn),與LRP的其他配體相比，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF對(duì)LRP有非常高的親合力；而其他配體與LRP具有中等親合力。目前,CTGF與LRP之間高親合力的機(jī)制尚不清楚,但這種高親合力提示，LRP會(huì)在介導(dǎo)CTGF的生物學(xué)效應(yīng)方面起重要作用；經(jīng)基因敲除LRP基因缺陷細(xì)胞不能結(jié)合CTGF等研究證實(shí),LRP是CTGF的受體,CTGF在細(xì)胞的快速內(nèi)吞和降解過程依賴LRP[5]。LRP6作為CTGF受體之一，不僅與CTGF結(jié)合，還參與發(fā)育[6]。VEGFR2又稱激酶功能區(qū)受體(kinase domain receptor，KDR),不僅是受體酪氨酸蛋白激酶。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子型受體2(VEGFR2)同時(shí)還是VEGF的主要功能受體。作為受體型酪氨酸激酶，主要通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂趨化作用以及新生血管的形成，除此之外，還在抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、維持內(nèi)皮細(xì)胞存活方面發(fā)揮重要作用[7]。VEGFR2與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)。CTGF和VEGF與低氧條件下的肺有著十分緊密的聯(lián)系[8-9]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)LRP6和VEGFR2在肺癌、非小細(xì)胞肺癌和大鼠肺內(nèi)的分布特點(diǎn)進(jìn)行了研究[10-15]。本課題組之前對(duì)牦牛肺的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行過較為詳細(xì)的研究[16-17]。研究表明,CTGF表達(dá)與分布是成年牦牛的基礎(chǔ)分布，成年牦牛肺并未發(fā)生典型的肺纖維化或肺動(dòng)脈高壓的病理特征，即成年牦牛并未產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓。而在低氧環(huán)境下能刺激初生牦牛肺內(nèi)VEGF含量增高，從而對(duì)牦牛的發(fā)育產(chǎn)生影響。但有關(guān)LRP6和VEGF在牦牛肺的分布特點(diǎn)未見報(bào)道。

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附方法、Western blot和免疫組織化學(xué)，對(duì)LRP6和VEGFR2在初生、半歲、成年和老年牦牛肺準(zhǔn)確分布位置和表達(dá)量進(jìn)行觀察比較，為低氧環(huán)境下牦牛肺適應(yīng)性結(jié)構(gòu)的形成和機(jī)理提供部分理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為心肺疾病的治療、高原醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的研究提供部分理論資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及材料

本試驗(yàn)以牦牛為研究對(duì)象，分別采集新生(1～7日 齡)、半歲(5～6月齡)、成年(3～6歲)和老年(7～10 歲)健康牦牛肺組織樣品，每個(gè)年齡段各5頭 份，經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死后，迅速采集肺膈葉的肺組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，脫水、石蠟包埋，切片厚4 μm。其中新生牦牛購(gòu)自甘肅省甘南自治州，其余組別牦牛購(gòu)自青海省西寧市。

1.2 ELISA檢測(cè)

1.2.1 材料 ELISA試劑盒購(gòu)于武漢基因美生物科技有限公司(LRP6，JYM0135Bo；VEGFR2，JYM0139Bo)。

1.2.2 蛋白樣品的提取 采集組織樣本后，稱重。加入一定量的PBS(pH7.4)。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后，仍然保持2～8 ℃的溫度。加入一定量的PBS(pH7.4)，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心5 min(2 000～3 000 r·min-1)。收集上清液。分裝后，1份備用，其余-20 ℃冷凍保存。

1.2.3 方法 采用雙抗夾心ELISA法，用純化的LRP6和VEGFR2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被抗體的微孔中依次加入LRP6和VEGFR2，再與HRP標(biāo)記的LRP6和VEGFR2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后，加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)為藍(lán)色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下的測(cè)定吸光值(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中LRP6和VEGFR2濃度。

1.3 Western-blot檢測(cè)

1.3.1 蛋白樣品的制備 取各個(gè)年齡段牦牛肺組織樣品各0.1 g，分別加入等量的組織均質(zhì)緩沖液(1 mLRIPA+10 μLPMSF)，冰浴搖勻2 h，然后4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 方法 取各年齡段牦牛肺的總蛋白各60 μL，分別加入20 μL溴酚藍(lán)混勻，100 ℃煮10 min，冰上5 min，然后將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,再用濕轉(zhuǎn)法將其電極轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(NC)上，從正極～負(fù)極的順序按4層濾紙、NC膜、凝膠塊、4層濾紙的順序擺放整齊，然后經(jīng)50 g·L-1脫脂奶粉溶液室內(nèi)封閉1.5 h，分別用LRP6和VEGFR2抗體4 ℃過夜孵育，用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG溫孵育1.5 h，每步完成后,用PBST洗膜，每次洗10 min，最后用ECL避光顯色，X光顯影、定影。掃描蛋白印跡條帶。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

1.4.1 抗體及檢測(cè)系統(tǒng) 抗體和SP試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司(Rabbit Anti-LRP6，bs-2905R；Rabbit Anti-VEGFR2，bs-10412R)；DAB 顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片貼于免疫組化防脫切片上。60 ℃烘片4～6 h。切片脫蠟至水，蒸餾水浸泡5 min，PBS浸泡5 min。按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行處理，DAB顯色。LRP6多克隆抗體和VEGFR2多克隆抗體均按照1∶400稀釋后使

用，空白對(duì)照用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗。

1.4.3 結(jié)果判定 以陽性表達(dá)強(qiáng)度為判定標(biāo)準(zhǔn)。深棕黃色為強(qiáng)陽性表達(dá)，淺棕黃色為陽性表達(dá)，淺黃色為弱陽性表達(dá)，接近背景色或無色為陰性。照片均通過Olympus-BX51生物顯微鏡和Olympus DP73照相系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)LRP6和VEGFR2在牦牛肺的濃度

由表1和圖1A可知，LRP6在初生和半歲的濃度均差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年的LRP6濃度值均差異顯著(P<0.05)，成年和老年的LRP6濃度差異顯著(P<0.05)。由表1和圖1B可知，VEGFR2在初生和半歲的濃度差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年的VEGFR2濃度差異均顯著(P<0.05)，成年和老年的VEGFR2濃度差異顯著(P<0.05)。

表1LRP6和VEGFR2在不同年齡牦牛肺的濃度

Table1TheconcentrationofLRP6andVEGFR2inthelungofyaksatdifferentages

年齡 Age初生Newborn半歲Juvenile成年Adult老年Old LRP6 /(pg·mL-1)133.357±3.341c143.272±4.321c190.278±2.935b242.323±1.987aVEGFR2 /(mg·mL-1)136.028±2.414c140.074±3.040c173.378±4.186b241.954±3.909a

同一行字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，同一行字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)

Different letters mean significant differences in the same row among different groups (P<0.05), same letters mean no difference in the same row among different groups (P>0.05)

不同年齡組間，字母不同代表組間差異顯著(P<0.05)，字母相同代表組間差異不顯著(P>0.05)。下同Different letters mean significant differences among diferent age groups (P<0.05), same letters mean no difference among diferent age groups (P>0.05).The same as below圖1 LRP6(A)和VEGFR2(B)在不同年齡牦牛肺的濃度Fig.1 The concentration of LRP6 (A) and VEGFR2(B) in the lung of yaks at different ages

2.2 Western-blot檢測(cè)LRP6和VEGFR2在不同年齡牦牛肺的表達(dá)

由圖2B可知，LRP6在初生和半歲牦牛肺的表達(dá)均差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年牦牛肺LRP6表達(dá)均差異顯著(P<0.05)，成年和老年牦牛肺LRP6表達(dá)差異顯著(P<0.05)。由圖2C可知，在初生和半歲牦牛肺VEGFR2表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年牦牛肺VEGFR2表達(dá)均差異顯著(P<0.05)，成年和老年牦牛肺VEGFR2表達(dá)差異顯著(P<0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察LRP6和VEGFR2在不同年齡牦牛肺中的分布與表達(dá)

2.3.1 LRP6在牦牛肺的分布和表達(dá)情況 LRP6在初生和半歲年齡段牦牛肺的分布和表達(dá)量基本一致，在細(xì)支氣管(圖3a)、終末細(xì)支氣管(圖3b)、呼吸性細(xì)支氣管(圖3c)上皮細(xì)胞中以及肺泡

A. Western-blot結(jié)果; B. LRP6; C. VEGFR2A.The result of Western-blot; B. LRP6; C. VEGFR2圖2 不同年齡中LRP6和VEGFR2蛋白在牦牛肺的表達(dá)Fig.2 The expressions of LRP6 and VEGFR2 protein in yak lung at different ages

Ⅱ型細(xì)胞中(圖3d)呈弱陽性表達(dá)，在細(xì)支氣管動(dòng)脈(圖3a)、伴行肺動(dòng)脈(圖3b)內(nèi)膜上皮細(xì)胞和平滑肌也有分布，呈陽性表達(dá)。成年牦牛肺細(xì)支氣管(圖3e)、終末細(xì)支氣管(圖3f)上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型細(xì)胞成陽性表達(dá)，呼吸性細(xì)支氣管(圖3g)上皮細(xì)胞的表達(dá)和初生以及半歲基本一致。而在老年牦牛肺細(xì)支氣管(圖3h)、終末細(xì)支氣管(圖3i)、呼吸性細(xì)支氣管(圖3j)上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在細(xì)支氣管肺動(dòng)脈和肺泡Ⅱ型細(xì)胞(圖3k)中也有大量分布，呈強(qiáng)陽性表達(dá)。圖3l為空白對(duì)照。

2.3.2 VEGFR2在牦牛肺的分布情況 VEGFR2在初生和半歲年齡段牦牛肺的分布和表達(dá)量也基本一致，在細(xì)支氣管(圖4a)、終末細(xì)支氣管(圖4b)、呼吸性細(xì)支氣管(圖4c)上皮細(xì)胞中和平滑肌細(xì)胞以及肺泡Ⅰ型細(xì)胞中(圖4d)呈弱陽性表達(dá)，在細(xì)支氣管動(dòng)脈(圖4a)、伴行肺動(dòng)脈(圖4b)內(nèi)膜細(xì)胞也有分布，也呈弱陽性表達(dá)。在成年牦牛肺在細(xì)支氣管(圖4e)上皮和管壁平滑肌中強(qiáng)陽性表達(dá)；在終末細(xì)支氣管(圖4f)只有上皮有陽性表達(dá)及管壁平滑肌中無表達(dá)；在呼吸性細(xì)支氣管(圖4g)和Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和肺泡隔細(xì)胞(圖4h)內(nèi)強(qiáng)陽性表達(dá)。在伴行肺動(dòng)脈血管壁平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)(圖4f)。而在老年牦牛肺細(xì)支氣管(圖4i)、終末細(xì)支氣管(圖4j)、呼吸性細(xì)支氣管上皮和管壁平滑肌中以及Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和肺泡隔細(xì)胞(圖4k)上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，圖4l為空白對(duì)照。

a.初生牦牛肺細(xì)支氣管及肺動(dòng)脈；b.半歲牦牛肺終末細(xì)支氣管及伴行動(dòng)脈；c.初生牦牛肺呼吸性細(xì)支氣管；d.半歲牦牛肺泡囊；e.成年牦牛肺細(xì)支氣管及肺動(dòng)脈；f.成年牦牛肺終末細(xì)支氣管及伴行動(dòng)脈；g.成年牦牛肺呼吸性細(xì)支氣管；h.老年牦牛肺細(xì)支氣管及肺動(dòng)脈；i.老年牦牛肺終末細(xì)支氣管及伴行動(dòng)脈；j.老年牦牛肺呼吸性細(xì)支氣管；k.老年牦牛肺泡囊；l.空白對(duì)照。B.細(xì)支氣管；TB.終末細(xì)支氣管；RB.呼吸性細(xì)支氣管；PA.肺動(dòng)脈；AS.肺泡囊。下同a.Newborn yak lung bronchioles and pulmonary arteries; b.Juvenile yak lung terminal bronchiole and accompanying artery; c.Newborn yak lung respiratory bronchioles; d.Juvenile yak lung alveolar sac; e.Adult yak lung bronchioles and pulmonary arteries; f.Adult yak lung terminal bronchioles and accompanying arteries; g. Adult yak lung respiratory bronchioles; h.Old yak lung bronchioles and pulmonary arteries; i.Old yak lung terminal bronchioles and accompanying artery; j.Old yak lung respiratory bronchioles; k.Old yak lung alveolar; l. The blank control; B.Bronchioles; TB.Terminal bronchioles; RB. Respiratory bronchioles; PA.Pulmonary artery; AS.Alveolar sacs. The same as below圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)LRP6在不同年齡牦牛肺的表達(dá)(a、c、d、e、g、h、i、k、l:400×；b、f、j：200×)Fig.3 Immunohistochemical expression of LRP6 in the lung of yak at different ages(a,c,d,e,g,h,I,k,l：400×；b,f,j：200×)

表2LRP6在不同年齡牦牛肺中的表達(dá)情況

Table2TheLRP6expressioninthelungatdifferentagesyak

年齡Age細(xì)支氣管Bronchioles肺動(dòng)脈Pulmonary artery終末細(xì)支氣管Terminal bronchiole上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle內(nèi)膜Ti中膜Tm外膜Ta上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle呼吸性細(xì)支氣管Respiratorybronchiole肺泡囊Alveolar sacs初生 Newborn+++-+++++半歲Juvenile+++-+++++成年Adult++++++++++++老年Old++++++++++++++

+++.強(qiáng)陽性表達(dá)；++.陽性表達(dá)； +.弱陽性表達(dá)；-.陰性表達(dá)。下同

+++.The strong positive expression; ++.The positive expression; +.The weak positive expression; -.The negative expression. The same as below

圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)VEGFR2在不同年齡牦牛肺的表達(dá)(a、c、d、e、g、h、i、k、l:400×；b、f、j:200×)Fig.4 Immunohistochemical expression of VEGFR2 in the lung of yak at different ages(a,c,d,e,g,h,i,k,l:400×；b,f,j:200×)

表3VEGFR2在不同年齡牦牛肺中的表達(dá)情況

Table3TheVEGFR2expressioninthelungatdifferentagesyak

年齡Age細(xì)支氣管Bronchioles肺動(dòng)脈Pulmonary artery終末細(xì)支氣管Terminal bronchiole上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle內(nèi)膜Ti中膜Tm外膜Ta上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle呼吸性細(xì)支氣管Respiratorybronchiole肺泡囊Alveolar sacs初生Newborn+++++++++半歲Juvenile+++-+++++成年Adult+++++++++++老年Old++++++++++++++

3 討 論

VEGFR2廣泛存在于正常機(jī)體的組織器官中。筆者觀察到肺內(nèi)VEGFR2主要分布于肺泡Ⅱ型細(xì)胞，支氣管上皮細(xì)胞、肺血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞也有VEGFR2表達(dá)。生長(zhǎng)發(fā)育過程中，肺組織內(nèi)皮血管增生、遷移、出芽、新生心血管形成與細(xì)胞外基質(zhì)重塑都需要VEGFR2參與[18]。有研究證實(shí)在新生大鼠予以VEGFR2受體拮抗劑后肺組織內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，出現(xiàn)肺氣腫樣病變[19]。VEGFR2與血導(dǎo)管、血管形成和造血有關(guān)。提示VEGFR2是血導(dǎo)管生成的主要調(diào)控因子[20]。Hanahan和Folkman[21]1996年提出了“血管形成的開關(guān)平衡假說”，認(rèn)為血管生成受多種促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的共同調(diào)控，當(dāng)生長(zhǎng)因子的濃度下降時(shí)，開關(guān)處于開放狀態(tài)導(dǎo)致血管形成。成年時(shí)期由于肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞增生不活躍，此時(shí)VEGFR2可能對(duì)維持肺血管的正常生理功能起一定的作用。VEGFR2是血管生長(zhǎng)和發(fā)育的主要調(diào)節(jié)者，它們不僅在內(nèi)皮細(xì)胞上有表達(dá)，在非內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)。說明VEGFR2可能在維持正常生理狀況及抗損傷修復(fù)中發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，牦牛肺組織中的VEGFR2表達(dá)也逐漸上升，本研究結(jié)果與Hanahan和Folkman[21]對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在大鼠肺發(fā)育過程中的表達(dá)研究結(jié)果不同，大鼠肺內(nèi)VEGFR2不僅在胎兒及新生兒肺內(nèi)表達(dá),以后也持續(xù)存在,但水平很低。這可能表明牦牛隨著年齡的增長(zhǎng)，肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移能力顯著上升,其抗損傷能力也隨之上升。肺內(nèi)VEGFR2逐漸增加以滿足其生長(zhǎng)需要，說明可能與牦牛所處的高原低氧環(huán)境有關(guān)系。

LRP6是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑必不可少的受體[6]，通過LRP6抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)降低了肺癌細(xì)胞體內(nèi)自我更新的能力[22]。Wnt信號(hào)途徑是胚胎早期發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的關(guān)鍵途徑，使細(xì)胞沿著某一方向定向分裂，使新產(chǎn)生的細(xì)胞定位于某個(gè)區(qū)域，決定著細(xì)胞分化的命運(yùn)[23]， 并在涉及肺癌發(fā)展的多個(gè)過程中發(fā)揮作用[24]。LRP6與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF有高度的結(jié)合能力，證實(shí)LRP6是CTGF的受體之一[5]。筆者觀察到LRP6在牦牛不同發(fā)育時(shí)期肺組織中支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和肺動(dòng)脈等也均有表達(dá)。這與Wang等[25]對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通過LRP6作用激活上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的研究結(jié)果相似。隨著已有大量研究報(bào)道LRP6作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的受體可調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和生長(zhǎng)促進(jìn)血管生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)血管生成因子的產(chǎn)生或活性，并參與直接和間接的血管生成調(diào)節(jié)機(jī)制，從而引起肺動(dòng)脈和小動(dòng)脈重塑[26-28]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明：1)在分布區(qū)域上，VEGFR2和LRP6均在肺內(nèi)支氣管及其分支的上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞表達(dá)較高。2)在年齡方面，LRP6和VEGFR2在牦牛肺組織中表達(dá)豐富且在不同年齡段的表達(dá)有差異。說明這2種因子可能共同作用于牦牛肺細(xì)胞，促進(jìn)肺動(dòng)脈重建以抵抗高原低氧對(duì)肺的損傷。為進(jìn)一步研究高原低氧對(duì)牦牛肺的損傷，還需對(duì)牦牛肺進(jìn)行更深入的研究，從而為探索治療肺疾病提供新的思路。