基于網絡藥理學探討丹紅注射液成分-抗血栓靶點的相互作用*

李泮霖，劉宏，廖弈秋，李沛波，姚宏亮，蘇薇薇

(中山大學生命科學學院∥廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心∥廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275)

丹紅注射液由丹參、紅花兩味藥組成，具有活血化瘀、通脈舒絡的功效，臨床上用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風，冠心病、心絞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性腦病、腦血栓。由其功能主治可以看出，抗血栓作用是丹紅注射液發揮藥效的關鍵。現代研究表明，在激光誘導的大鼠動脈血栓模型[1]和大鼠急性血瘀模型[2]中，丹紅注射液均顯示出很好的抗血栓、溶栓作用；對其相關的藥理作用機制，也進行了一些初步探討[3-4]。但是，目前的研究仍僅關注單個或少數幾個指標及蛋白的變化，未能對其多成分多靶點作用機制進行解釋。

網絡藥理學技術整合了化學、醫學、生物數據，使用計算模擬建立藥理學性質預測模型，為闡明中藥復方制劑多成分、多靶點作用機制及其相應的藥效物質基礎提供了一種可行的方法[5]。本研究采用Surflex-Dock分子對接方法，研究丹紅注射液化學成分與抗血栓靶點間的相互作用，并建立其化學成分-靶點網絡，為闡明丹紅注射液抗血栓作用的分子機制提供依據。本研究對于豐富丹紅注射液的科學內涵，指導其臨床用藥具有實際意義。

1 方 法

1.1 化學成分

前期已采用UFLC-PDA-Triple TOF-MS/MS技術[2]，確證及指證了丹紅注射液中的82個化學成分，并明確了各成分的藥材歸屬。通過檢索NCBI PubChem數據庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/pccompound)及Chemical Book 數據庫(http:∥www.chemicalbook.com)，獲得各化學成分的分子結構，其結構文件均儲存為mol格式，作為分子對接的配體。

1.2 抗血栓作用相關靶點數據庫

前期已建立了抗血栓作用相關靶點數據庫[6]，該數據庫由115個候選蛋白質靶點組成，其X射線晶體結構從RCSB Protein Data Bank(http:∥www. pdb.org/)中下載，作為分子對接的受體。

1.3 分子對接

采用計算機模擬分子對接方法，以蛋白質-配體復合物的晶體結構為中心，參考缺省參數進行各化學成分與各候選蛋白靶點的分子模擬對接。以Surflex-Dock預測的分子受體和配體的最佳對接姿態的結合能作為評價參數，將與每個分子配體(各化學成分)結合能大于6的分子受體(各候選蛋白靶點)作為陽性結果(潛在靶點)，用于構建成分-靶點網絡[6]。

1.4 網絡的構建與分析

利用Cytoscape3.3.0軟件(http:∥www.cytoscape.org/)對計算結果進行可視化處理，構建成分-靶點網絡。應用Cytoscape軟件中的ClueGO插件，對丹紅注射液抗血栓作用相關靶點進行KEGG信號通路分析，設定P<0.05。

2 結 果

2.1 丹紅注射液成分與抗血栓作用相關靶點分子對接結果

將丹紅注射液82個化學成分，分別與抗血栓相關靶點數據庫中的115個蛋白靶點進行分子對接，結果表明：丹紅注射液中有60個成分與106個抗血栓作用靶點間存在2 028條關聯(表1、表2)，使用Cytoscape軟件進行可視化處理，構建了成分-靶點網絡圖(圖1)。

從表1可以看出，在與丹紅注射液成分有關聯的潛在靶點中，與血栓形成關聯密切的重要靶點排名均很靠前，包括F2(凝血因子Ⅱ)、REN(腎素)、F13A(凝血因子XIIIa)、PROC(蛋白C—凝血因子Ⅴa及Ⅷa抑制劑)、PGH2(前列腺素G/H合酶2)、ACE(血管緊張素轉化酶)、PLAU(尿激酶型纖溶酶原激活物)和SERPINC1(抗凝血酶)等，這些靶點分別涉及凝血、纖溶系統以及血管生成、收縮舒張等多個系統，提示這些靶點是丹紅注射液的主要藥效靶點。

表1 丹紅注射液的潛在抗血栓作用靶點(關聯化合物數≥35)Table 1 The potential anti-thrombotic targets of Danhong Injection

從表2可以看出，丹紅注射液中丹酚酸類成分與大多數血栓靶點均有較好的結合，表明丹酚酸類是丹紅注射液抗血栓作用的主要藥效物質基礎。

表2 丹紅注射液的抗血栓活性成分Table 2 The anti-thrombotic compounds in Danhong Injection

續表2

1) 化合物編號與文獻[2]一致

同時，通過ClueGO插件對丹紅注射液抗血栓作用靶點涉及的KEGG信號通路進行分析，結果如圖2所示。從圖2可以看出，丹紅注射液抗血栓作用靶點主要富集于Complement and coagulation cascades、cAMP signaling pathway、Calcium signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Renin-angiotensin system信號通路等。

圖1 丹紅注射液成分-抗血栓作用相關靶點網絡圖(化合物編號對應的化合物名稱見表2)Fig.1 The compound-antithrombotic target network of Danhong Injection( The compound name corresponding to the compound No. was showed in Table 2)

2.2 丹紅注射液指紋圖譜色譜峰的靶點分析

前期我們構建了丹紅注射液生物活性指紋圖譜[2]，包括13個主要色譜峰，分別為5-羥甲基糠醛(1)、丹參素(2)、原兒茶醛(3)、羥基紅花黃色素A(4)、對香豆酸(5)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、紫草酸甲酯(9)、迷迭香酸(10)、紫草酸(11)、丹酚酸B(12)、丹酚酸A(13)。因此，對這13個色譜峰的相關靶點作進一步分析(圖3)。

圖2 丹紅注射液抗血栓作用的成分-靶點-信號通路網絡圖(化合物編號對應的化合物名稱見表2)Fig.2 The compound-antithrombotic target-signaling pathway network of Danhong Injection(The compound name corresponding to the compound No. was showed in Table 2)

圖3 丹紅注射液13個指紋圖譜色譜峰的靶點分析1: 5-羥甲基糠醛; 2: 丹參素; 3: 原兒茶醛; 4: 羥基紅花黃色素A; 5: 對香豆酸；6: 丹酚酸H；7: 丹酚酸I；8: 丹酚酸D；9: 紫草酸甲酯；10: 迷迭香酸；11: 紫草酸；12: 丹酚酸B；13: 丹酚酸AFig.3 The target analysis of 13 main compounds in Danhong Injection1：5-Hydroxymethyl furfural；2：Danshensu；3：Protocatechualdehyde；4：Hydroxysafflor yellow A；5： p-Coumaric acid；6：Salvianolic acid H；7：Salvianolic acid I；8：Salvianolic acid D；9：Monomethyl lithospermate；10：rosmarinic acid；11：Lithospermic acid；12：Salvianolic acid B；13：Salvianolic acid A

結果表明，13個色譜峰與凝血、纖溶系統以及血管生成、收縮舒張等多個系統的靶點具有相互關聯。關聯靶點較多的成分為丹酚酸A(13)、迷迭香酸(10)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、丹酚酸B(12)；而5-羥甲基糠醛(1)、原兒茶醛(3)、對香豆酸(5)關聯靶點個數較少，說明其對抗血栓藥效貢獻較小。

3 討 論

通過本研究，得出106個蛋白靶點與60個丹紅成分間存在2 028個相互作用。其中，F2、F13A、SERPINC1、PGH2、ACE、REN、PLAU和PROC是已知與血栓形成密切相關、且與丹紅注射液化學成分有較強結合的靶點；在抗血栓活性成分中，丹酚酸類成分占主導地位。

F2、F13A同為凝血因子，通過外源性和內源性凝血途徑的級聯傳遞介導凝血酶原酶復合物的形成、凝血酶原的轉變以及最終的凝血過程和血栓形成；其中F2在整個過程中發揮著核心作用[7]。SERPINC1是血漿中最重要的抗凝物質之一，可抑制50%～60%的凝血酶和凝血因子Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺ、Ⅻa的激活，從而阻止血液凝固。PGH2可以影響花生四烯酸誘導的血小板聚集和血栓形成[8]。除了上述凝血和抗凝系統的關鍵靶點，丹紅注射液抗血栓作用的主要靶點還包括腎素-血管緊張素系統中的REN和ACE，與血壓的穩定和調節直接相關[9]。研究表明，ACE作為RAS系統最主要的成員，除介導血管平滑肌細胞收縮引起血壓升高外，還介導血管壁的慢性炎癥反應，進而參與動脈粥樣硬化的發生與發展[10]。此外，丹紅注射液還與纖溶系統的PLAU和PROC靶點關聯密切。PLAU作為纖溶酶原的激活劑，通過激活PLG(纖溶酶原)為纖溶酶發揮溶栓作用。PROC可同時作用于抗凝系統及纖溶系統，其被激活后，在磷脂和Ca2+存在時，可滅活FⅤa、FⅧa；阻礙FⅩa與血小板上的磷脂結合，削弱FⅩa對凝血酶原的激活作用；刺激纖溶酶原激活物釋放，增強纖溶酶活性，促進纖維蛋白溶解[11]。

靶點信號通路分析結果顯示，丹紅注射液活性成分相關的作用靶點主要參與Complement and coagulation cascades、cAMP signaling pathway、Calcium signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Renin-angiotensin system等信號通路。這些通路涉及凝血功能、內皮功能、血管收縮舒張等多個方面，共同維護機體血液循環系統的動態平衡，抑制血栓形成或出血[12]。丹紅注射液同一成分或不同成分同時作用于多個通路的靶點，也體現了中成藥多成分、多靶點、綜合調控的作用特點。

中藥成分復雜，單個成分在體內的濃度往往達不到其有效濃度[13]，但在動物實驗及臨床中，又可觀察到較好的療效。本研究中，丹紅注射液多個成分同時與凝血通路中的不同靶點相互作用，可能由此引發凝血級聯效應而發揮藥效。整體藥效到底是由于不同成分間的相互協同、加和還是拮抗，尚有待進一步研究。

在丹紅注射液指紋圖譜13個主要色譜峰中，丹參素(2)、羥基紅花黃色素A(4)、對香豆酸(5)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、紫草酸甲酯(9)、迷迭香酸(10)、紫草酸(11)、丹酚酸B(12)、丹酚酸A(13)為核心活性成分群[2]。本研究中，網絡藥理學結果表明，丹酚酸A(13)、迷迭香酸(10)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、丹酚酸B(12)關聯靶點較多。兩種方法獲得的丹紅活血化瘀活性成分基本一致，可以相互印證。本研究為進一步闡明丹紅注射液多成分、多靶點分子作用機制提供了依據。