鈣敏感受體在大鼠腎草酸鈣結石形成中的作用

李 朋，王勤章，錢 成，徐 浩，申茂磊，郝志強，錢 彪

石河子大學醫學院第一附屬醫院 泌尿外科，新疆石河子 832000

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病之一，其中腎結石比較多見，但腎結石的形成機制和發病原因目前仍未完全明確。腎部位的結石主要為草酸鈣等含鈣結石[1-2]，有研究表明鈣的代謝異常是導致含鈣尿路結石形成的重要因素之一，高鈣尿引起尿液相對過飽和誘發了含鈣結石的形成[3]。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)會使腎小管髓袢升支粗段鈣的重吸收受到抑制，尿鈣排泄率增加，進而形成高鈣尿誘發了含鈣結石的形成[4-6]。我們推測CaSR在大鼠腎草酸鈣結石的形成過程中起著非常重要的作用。本研究對CaSR在草酸鈣結石形成過程中表達水平進行動態觀察，對其在結石形成中的作用機制進行初步探討。

材料和方法

1材料 SPF級雄性Wistar大鼠60只，6周齡左右，體質量(210±15) g，購自新疆醫科大學實驗動物中心[合格證號SCXK(新)2013-0001]。多功能光學顯微鏡及圖像采集系統(BX40，日本Olympus公司)，CaSR抗體(英國Abcam公司)。

2大鼠腎結石模型的建立及實驗分組 參照孫穩[7]的方法制作大鼠腎結石模型。適應性喂養1周后按照隨機數字表法將60只SPF級雄性Wistar大鼠分為空白對照組與結石組，每組各30只。空白對照組給予正常飲水每日每只2 ml灌胃2周；結石組給予1%乙二醇飲水和2%氯化銨每日每只2 ml灌胃2周。1 ～ 10周每組每周處死3只大鼠并取其雙側腎標本。

3腎組織形態學檢測 連續10周肉眼觀察大鼠腎形狀、體積大小以及顏色變化；兩側腎各取一部分組織用甲醛液固定，石蠟包埋后使用解剖顯微鏡進行大體形態及結石晶體形成觀察。

4腎組織HE染色 將一部分石蠟包埋后的腎組織標本制成切片，將切片固定于載玻片上，常規HE染色切片，光學顯微鏡下觀察結晶的形成情況及腎病理改變，并按照文獻[8]提供的腎結晶分級判定標準進行統計，0級判定為陰性結果，表示腎組織內未發現有結晶形成；Ⅰ～Ⅳ級判定為陽性結果，分別表示腎組織內結晶形成的程度。

5免疫組織化學檢測CaSR的表達 選取成功建立模型的另一部分腎組織做免疫組織化學染色。免疫組化采用SP法，石蠟包埋后切片4μm，常規脫蠟，H2O2處理清除內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液抗原修復，血清封閉。滴加CaSR抗體(1∶150)，4℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染，不同濃度乙醇和二甲苯脫水，樹膠封片，顯微鏡下觀察1 ～ 10周兩組Wistar雄性大鼠腎CaSR免疫組織化學染色情況。

結 果

1腎組織HE染色病理改變 光學顯微鏡下觀察，造模期間正常對照組大鼠腎組織冷凍切片內未見結晶沉積，無病理學改變(圖1A)。第2周起結石組部分大鼠腎可見腎小管上皮細胞脫落或腎間質淋巴細胞浸潤及數量不等透明晶體，多數晶體以不規則碎片出現于腎小管中，部分見于集合管、間質及被膜下，并伴有部分腎小管擴張、上皮細胞空泡樣變性及小管上皮腫脹；第5 ～ 10周腎組織結晶量多，細胞排列紊亂，腎小管多畸形，腎小管管腔擴大或因上皮細胞腫脹而變窄，擴大腔內多有壞死脫落樣物，腎小球多形狀不規則甚至壞死，以腎小管內為著(圖1B)。

2腎結晶形成情況及分級 正常對照組大鼠腎組織未見結晶。第3周起結石組大鼠腎切片可見明亮晶體，主要分布于遠曲小管，近曲小管及部分腎小球周圍，形態不規則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體呈互相連接成片或成堆，結石組與正常對照組之間成石率(因結石組大鼠在第3周開始成石，而前兩周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計算成石率時將兩組內前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計數之外)見表1。

圖 1 第9周兩組大鼠腎組織HE染色對比(HE×200) A：對照組；B： 結石組Fig. 1 Comparison of HE staining in renal tissue at the 9th week in both groups (HE×200) A: control group; B: calculi group

3腎組織CaSR免疫組織化學檢查結果 光學顯微鏡下觀察到第1 ～ 2周結石組與對照組大鼠腎組織均有CaSR的表達但沒有明顯差異，主要定位于腎小管上皮細胞的細胞膜上，呈棕褐色。第3 ～ 10周對照組大鼠腎組織CaSR的表達較第1 ～ 2周無明顯變化，結石組大鼠腎組織CaSR的表達強度則逐漸增強且明顯高于對照組，鏡下可見結石組腎組織CaSR呈高度表達且彌漫分布。見圖2。

表1 兩組大鼠腎組織結晶分級Tab. 1 Grading of crystallization in two groups

討 論

泌尿系結石以草酸鈣等含鈣結石最為多見[9-11]。尿液中游離鈣增高是泌尿系結石形成的主要危險因素[12-14]。鈣敏感受體是G蛋白偶聯受體家族的一員，在調節全身Ca2+動態平衡中起主要作用[15-16]。有研究表明，CaSR在腎表達于腎小管髓袢升支粗段[17]，激活后通過改變細胞旁途徑的滲透性來降低腎小管髓袢升支粗段對鈣的重吸收。據此我們推測，CaSR在腎草酸鈣結石的形成過程中起著重要的作用。

本研究結果發現第1 ～ 2周結石組與對照組大鼠腎組織病理改變無差異，免疫組化顯示兩組大鼠腎組織CaSR表達水平無明顯差異。第3周開始，結石組大鼠腎體積逐漸增大，顏色漸漸變淺和發白，皮髓結構不清晰，且在皮髓交界處可見淡黃色顆粒沉積，觸之有沙粒樣感覺；HE染色可見結石組大鼠腎切片有明亮晶體；免疫組化觀察到第3 ～ 10周結石組CaSR的表達程度逐漸增強且明顯高于對照組。而第3 ～ 10周對照組大鼠腎組織的HE染色結果以及腎組織中CaSR的表達水平與第1 ～ 2周相比并未發生明顯改變。因此筆者認為CaSR表達水平在大鼠腎組織含鈣結石的形成過程中起著至關重要的作用，可能是通過腎組織CaSR激活CaSR-緊密連接蛋白-14(Claudin-14)通路，Claudin-14高度表達能夠阻斷由Claudin-16和Claudin-19構成的細胞外陽離子通道，使細胞旁途徑的滲透性發生改變，從而降低了腎小管髓袢升支粗段對鈣的重吸收，Ca2+排泄增加，尿路中游離鈣增多，促進了含鈣結石的形成[18-19]。

綜上所述，本研究發現CaSR的表達強度在大鼠草酸鈣結石形成過程中存在動態改變，在結石形成過程中起著非常重要的作用，之后將進一步探討泌尿系含鈣結石的形成機制，為臨床治療提供有力依據。