海島棉CSSLs分子評價及纖維品質、產量性狀QTL定位

李 超 李志坤 谷淇深 楊 君 柯會鋒 吳立強 王國寧 張 艷 吳金華 張桂寅 閻媛媛 馬峙英 王省芬,*

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海島棉CSSLs分子評價及纖維品質、產量性狀QTL定位

李 超1,2李志坤1谷淇深1楊 君1柯會鋒1吳立強1王國寧1張 艷1吳金華1張桂寅1閻媛媛1馬峙英1王省芬1,*

1河北農業大學教育部華北作物種質資源研究與利用重點實驗室, 河北保定 071001;2中國農業科學院棉花研究所 / 棉花生物學國家重點實驗室, 河南安陽 455000

本課題組前期以陸地棉中棉所8號(CCRI8)為輪回親本, 海島棉Pima 90-53為供體親本培育了一套陸地棉中棉所8號為背景的海島棉染色體片段置換系(CSSLs), 本研究利用SSR標記對該置換系群體BC3F5進行基因型檢測, 在3個不同環境下(河北保定、青縣和新疆輪臺)鑒定其纖維品質和產量相關性狀并進行QTL定位。該置換系群體包含182個家系, 置換片段數在1~15個之間, 平均為6.6個; 導入片段長度在0.7~83.2 cM之間, 平均長度為16.8 cM; 置換片段總長度20 249.6 cM; 背景回復率在92.3%~99.6%之間, 平均為96.2%。共檢測出59個相關的QTL, 其中與纖維品質性狀相關的41個, 單個QTL的貢獻率為1.27%~26.66%; 與產量性狀相關的18個, 單個QTL的貢獻率為2.03%~19.38%; 檢測到14個穩定的QTL, 其中4個馬克隆值和2個纖維伸長率相關的穩定QTL增效基因均來自高值親本海島棉Pima 90-53, 2個鈴重相關的穩定QTL增效基因來自高值親本陸地棉中棉所8號。研究結果為深入開展纖維品質和產量性狀的QTL精細定位、QTL間互作和分子育種提供了理論依據。

陸地棉; 海島棉; 染色體片段置換系; 纖維品質; 產量; QTL定位

棉花纖維品質和產量性狀易受環境影響, 屬于多基因控制的數量性狀, 遺傳機制比較復雜。通過常規育種方法改良纖維品質和產量性狀已經不能滿足現代農業生產的要求。隨著分子生物學的快速發展, 將纖維品質和產量性狀與分子標記結合起來統計分析, 在分子水平上探究多個環境下纖維品質和產量性狀的遺傳特性, 篩選出與纖維品質和產量性狀緊密連鎖且不受環境影響的標記, 從而用于分子標記輔助育種。

前人利用RIL、F2、F2:3等群體已經開展了很多與棉花纖維品質和產量性狀相關的研究[1-8], 但是這些群體的遺傳背景復雜, 嚴重制約了對目標性狀QTL的精細解析。染色體片段置換系群體遺傳背景只含有供體親本的一個或幾個染色體片段, 其他部分則與輪回親本完全相同, 能夠消除遺傳背景的噪音, 是進行QTL定位研究的理想材料。朱亞娟等[9]以染色體片段置換系IL-15-5和IL-15-5-1構建的F2和F2:3分離群體為基礎進行了衣分和子指QTL定位; Wang等[10]利用染色體片段置換系定位到43個加性QTL和6個上位性QTL; 付央等[11]培育了一套以TM-1為背景、含海島棉3-79第18染色體不同長度片段的置換系, 定位到纖維品質和產量性狀相關的7個加性QTL和5個上位性QTL; 沈超等[12]利用黃褐棉染色體片段導入系進行了產量和纖維品質性狀QTL定位; 解信美[13]培育了一套以陸地棉遺傳標準系TM-1為背景的闊葉棉染色體片段漸滲系; Guo等[14]利用海島棉染色體片段置換系鑒定出3個纖維品質相關的QTL位于第1和第11染色體, 單個QTL貢獻率為6.23%~10.73%; 何蕊等[15]利用陸地棉‘中棉所36’和海島棉‘海1’構建的染色體片段置換系, 對BC5F3、BC5F3:4、BC5F3:5開展了關于株高的QTL定位研究, 單個QTL的貢獻率為7.35%~13.17%。

本課題組前期培育了一套陸地棉‘中棉所8號’為背景的海島棉染色體片段置換系(CSSLs)[16], 本研究將利用SSR標記對該置換系群體BC3F5進行基因型檢測, 在3個生態環境差異較大的條件下鑒定其纖維品質、鈴重和衣分, 并定位其QTL。研究結果對于深入開展QTL的精細定位、QTL間互作和分子育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

置換系群體為包含182個材料的BC3F5。輪回親本為陸地棉品種中棉所8號(CCRI8), 非輪回親本為海島棉品種Pima 90-53。CCRI8產量高但纖維品質不如海島棉, Pima 90-53為產量低但纖維品質優良。

1.2 田間種植和表型鑒定

2016年采用隨機區組方式在生態環境差異很大的河北保定、青縣和新疆輪臺種植置換系群體。其中, 在河北保定種植點設置2次重復, 新疆輪臺和河北青縣種植點均設置3次重復, 每個材料1行, 行長7 m, 行距77 cm, 在青縣和保定株距約35 cm, 新疆株距約10 cm。在成熟期分別收取親本及BC3F5群體各株系吐絮正常的20個棉鈴, 晾干后稱重, 計算單鈴重。軋花后稱取皮棉重, 計算衣分(衣分=皮棉重/籽棉重×100%), 用USTER HVI 1000全自動纖維品質測定儀測定纖維品質。

1.3 棉花基因組DNA的提取

參考Paterson等[17]方法, 略作修改, 提取棉花葉片DNA。

1.4 SSR引物篩選及反應體系

王云鵬等[16]以陸地棉中棉所8號為輪回親本, 海島棉Pima 90-53為供體親本培育了一套海島棉染色體片段置換系。本研究在該圖譜的基礎上, 按照10~20 cM為標準挑選205個SSR標記, 包含221個多態性位點, 標記序列來自Cottongen (https://www. cottongen.org/)。SSR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

SSR擴增體系為20 μL, 含2×MasterMix II 10 μL, 上、下游引物(10 μmol L–1)各1 μL, DNA (50 ng μL–1)模板1 μL, ddH2O 7 μL。擴增程序為94℃預變性5 min; 94℃變性45 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸60 s, 30個循環; 72℃延伸5 min, 4℃保存。PCR產物用QIAxcel DNA High Resolution Kit (1200)檢測單株的基因型。

1.5 染色體片段置換系基因型檢測

染色體片段置換系擴增產物帶型如圖1所示, 與CCRI8一致的記作“a”, 與Pima 90-53一致的記作“b”, 雜合帶型記作“h”, 缺失的記錄為“-”。

1.6 染色體片段置換系遺傳組成分析

結合182個BC3F5株系基因型結果, 利用GGT 2.0軟件分析株系基因型, 計算染色體片段置換系的背景回復率和導入片段長度。

置換系遺傳背景回復率:() = [+()]/(2); 理論遺傳背景回復率:[()] = 1–(1/2)+1。其中,()代表回交代后基因型為受體親本的標記數量,代表標記總數。

圖1 SSR引物擴增型

a: CCRI8基因型; b: Pima 90-53基因型; h: 雜合帶型; –: 缺失帶型。

a: CCRI8 genotype; b: Pima 90-53 genotype; h: heterozygous genotype; –: missing genotype.

參照Young等[18]的方法分析導入片段長度,代表A、B位點之間的遺傳距離,代表B、C位點之間的遺傳距離,代表B位點導入片段長度(圖2), 則= 1/2(+)。

圖2 導入片段長度分析示意圖

1.7 數據統計分析方法和QTL定位

使用SPSS 19.0軟件對置換系BC3F5群體的纖維品質和產量性狀進行描述統計分析和相關性分析。利用QTL IciMapping V4.0軟件, 結合完備區間作圖法對置換系BC3F5群體纖維品質和產量性狀進行QTL定位分析, 設置步長為1 cM, LOD大于3.0。QTL以“小寫字母q-目標性狀英文縮寫名-染色體代號-QTL數目-環境代號”命名, 比如與纖維伸長率相關的QTL命名為、和, 其中, 1、2、3分別代表第1、第2、第3染色體, 4、5、6分別代表與纖維伸長率相關的QTL個數, 7、8、9分別代表保定、輪臺、青縣種植點。

2 結果與分析

2.1 染色體片段置換系基因型分析

利用作圖軟件GGT2.0對182個置換系做基因型分析, 結果顯示, 染色體片段置換系大部分目標片段是純合供體親本片段, 雜合率為1.60%, 置換片段數量較少, 長度較短, 且相鄰標記相互重疊(圖3)。

2.1.1 置換片段數量分布 置換系置換片段總數量為1203個, 置換片段數最少為1個, 最多為15個, 平均為6.6個。置換片段數量最少的株系僅有1個, 占0.5%; 置換片段數量為2~4個的株系共41個, 占22.5%; 置換片段數量為5~7個的株系最多, 共82個, 占45.1%; 置換片段數量8個以上的株系共58個, 占31.9% (圖4-A)。

2.1.2 置換片段長度分布 該置換系置換片段總長度為20 249.6 cM, 置換片段長度最長為83.2 cM, 最短為0.7 cM, 平均16.8 cM。單個置換片段長度小于15 cM的最多, 有697個, 占57.8%; 置換片段長度介于15.1~30.0 cM之間有384個, 占31.9%; 置換片段長度介于30.1~45.0 cM之間有79個, 占9.4%; 置換片段長度超過60.0 cM最少, 有11個, 占0.9% (圖4-B)。

2.1.3 置換系背景回復率分析 該置換系的背景回復率最低為92.3%, 最高為99.6%, 平均96.2%。高于背景回復率平均值的株系有100個, 占整個群體的55%, 而低于理論背景回復率93.7%的株系很少, 有18個, 占整個群體的9.9% (圖4-C)。

2.1.4 置換片段覆蓋情況 從表1可知, 置換片段覆蓋總長度為2842.1 cM, 用于構建置換系的染色體總長為2929.4 cM, 覆蓋率為97.0%。但是, 仍存在個別染色體缺失海島棉的置換片段, 其中, A4、A7、A12、D2、D7、D12未能完全覆蓋, 覆蓋率分別為80.3%、95.1%、88.9%、91.3%、91.3%和88.1%。A12缺失片段長度最長, 為19.1 cM, A7缺失片段長度最短, 為5.4 cM。

上述研究結果表明, 本研究所用的置換系其置換片段的含量在整個基因組中的比例已經很低, 適合進行重要性狀的QTL定位研究。

圖3 染色體片段置換系基因型

左側數字代表染色體編號(從下至上依次為A1、A2、……、A12、A13、D1、D2、……、D12、D13), 底部數字代表置換系編號(從左至右依次為CSSL1、CSSL2、……、CSSL181、CSSL182), 灰色、紅色、藍色分別代表受體親本基因型、純合供體親本基因型和雜合基因型。

The left number represents the chromosome number (from the bottom to the top is A1, A2, ..., A12, A13, D1, D2, ..., D12, D13), the bottom number represents the number of CSSLs (from left to right is CSSL1, CSSL2, ..., CSSL181, CSSL182), gray, red, blue represent the genotypes of recipient parent, homozygous donor parent, and heterozygous individual, respectively.

圖4 染色體片段置換系置換片段分析

A、B、C分別表示置換片段數量、置換片段長度、背景回復率。

A, B, C represent substituted segment number, substituted segment length, and background recoverage rate, respectively.

2.2 染色體片段置換系表型性狀分析

2.2.1 親本纖維品質和產量性狀統計分析 從表2可知, 陸地棉CCRI8的纖維品質各項指標均不如海島棉Pima 90-53表現優異, 但CCRI8的衣分和鈴重均優于Pima 90-53。

2.2.2 染色體片段置換系纖維品質和產量性狀統計分析 從表3可以看出, 保定種植點的纖維強度、馬克隆值、纖維整齊度, 青縣種植點的纖維伸長率, 輪臺種植點的馬克隆值、纖維伸長率峰度均略大于1, 近似正態分布; 其他性狀的峰度和偏度均小于1, 符合正態分布, 均適合進行QTL定位分析。

2.2.3 染色體片段置換系纖維品質和產量性狀相關分析 用SPSS 19.0軟件對染色體片段置換系的纖維品質和產量性狀各項指標進行相關分析表明, 保定、輪臺和青縣種植點纖維長度與強度均呈極顯著正相關, 整齊度與長度、強度均呈極顯著正相關; 保定和輪臺種植點纖維長度與伸長率均呈顯著負相關, 保定和青縣種植點纖維強度與馬克隆值分別呈極顯著和顯著正相關; 輪臺和青縣種植點衣分與鈴重均呈極顯著正相關(表4)。說明性狀間可能存在一因多效現象, QTL定位時可能會出現QTL區間包含多個性狀的情況。

2.2.4 纖維品質和產量性狀QTL定位 共定位到59個纖維品質和產量性狀相關的QTL, 包括41個纖維品質相關的QTL和18個產量性狀相關的QTL, 分布在20條染色體上, 貢獻率為1.27%~26.66%。其中, 在第11染色體檢測到8個相關的QTL, 第3、第15染色體均檢測到6個相關的QTL, 第5、第23染色體均檢測到5個相關的QTL, 第9染色體檢測到4個相關的QTL, 第1、第14、第16染色體均檢測到3個相關的QTL, 第4、第12、第21、第24染色體均檢測到2個相關的QTL, 第2、第6、第10、第13、第17、第19、第22、第26染色體均檢測到1個相關的QTL (表5)。從圖5可以看出, 13個與馬克隆值相關的QTL中, 有8個增效基因來源于高值親本Pima 90-53; 11個與鈴重相關的QTL中, 有8個增效基因來源于高值親本CCRI8。在3個環境中共定位到14個纖維品質和產量性狀相關的穩定QTL, 其中, 6個能在3個環境中重復檢測到, 分別是馬克隆值相關的QTL (、、)和纖維伸長率相關的QTL (、、); 有8個QTL能在2個環境中被檢測到, 分別是4個馬克隆值相關的QTL (、;、)、2個纖維伸長率相關的QTL (、)和2個鈴重相關的QTL (、)。發現馬克隆值相關的穩定QTL (、;、)和纖維伸長率相關的穩定QTL (、)增效基因均來自高值親本海島棉Pima 90-53, 鈴重相關的穩定QTL (、)增效基因來自高值親本陸地棉中棉所8號。

表1 染色體片段置換系置換片段覆蓋情況

2.2.5 遺傳圖譜與物理圖譜的共線性分析 以南京農業大學版本(AD1) genome NAU為參考序列, 利用MapChart 2.2軟件對存在穩定QTL的染色體分析發現, 其遺傳圖譜與物理圖譜存在共線性關系(圖6)。A5 (c5)與V5之間存在明顯的共線性排列模式; 而A3 (c3)與V3、A11 (c11)與V11、D7 (c16)與V7、D9 (c23)與V9之間標記存在明顯的重排。標記共線性分析比較對提高基因克隆效率和棉花育種有重要意義。

表3 染色體片段置換系纖維品質和產量性狀統計分析

>FL: 纖維長度; FS: 纖維強度; MIC: 馬克隆值; FE: 纖維伸長率; FU: 纖維整齊度; LP: 衣分; BW: 鈴重。

FL: fiber length; FS: fiber strength; MIC: Micronaire value; FE: fiber elongation; FU: fiber uniformity; LP: lint percentage; BW: boll weight.

表4 染色體片段置換系纖維品質、產量性狀間的相關系數

FL: 纖維長度; FS: 纖維強度; MIC: 馬克隆值; FE: 纖維伸長率; FU: 纖維整齊度; LP: 衣分; BW: 鈴重。*表示在< 0.05水平差異顯著,**表示在< 0.01水平差異顯著。

FL: fiber length; FS: fiber strength; MIC: Micronaire value; FE: fiber elongation; FU: fiber uniformity; LP: lint percentage; BW: boll weight.*indicates significant level at< 0.05;**indicates significant level at< 0.01.

表5 染色體片段置換系纖維品質和產量性狀相關QTL

(續表5)

FL: 纖維長度; FS: 纖維強度; MIC: 馬克隆值; FE: 纖維伸長率; FU: 纖維整齊度; LP: 衣分; BW: 鈴重。

FL: fiber length; FS: fiber strength; MIC: Micronaire value; FE: fiber elongation; FU: fiber uniformity; LP: lint percentage; BW: boll weight.

3 討論

染色體片段置換系只在個別區段與受體親本有差異, 所有與受體親本不同的性狀都可能和這些區段有關, 本研究使用的染色體片段置換系的遺傳背景與中棉所8號一致, 因此它與受體親本之間的差異理論上來源于導入片段海島棉Pima 90-53上的等位基因。在本研究中共檢測出41個纖維品質相關QTL, 其中有21個QTL的增效基因來源于海島棉Pima 90-53, 占總體比例的51.21%; 共檢測出18個產量性狀相關的QTL, 其中9個QTL的增效基因來源于陸地棉CCRI8, 這與前人研究結果較一致[19-20], 即不論是纖維品質性狀還是產量性狀, 高值親本和低值親本中都存在增效基因, QTL的增效基因既可能來源于高值親本, 也可能來源于低值親本。QTL是數量性狀位點, 除了受本身基因控制以外, 也受試驗環境的影響[21]。雖然在棉花纖維品質和產量性狀方面進行了很多QTL定位研究, 但是真正能夠用于標記輔助選擇的卻很少, 大多數還無法有效應用, 因此還需要繼續發掘在不同群體、不同環境下都能穩定檢測到的QTL。本研究在3個環境中共定位到14個纖維品質和產量性狀相關的穩定的QTL, 其中6個能在3個環境中被重復檢測到, 8個能在2個環境中被檢測到, 說明有的QTL相對比較穩定, 受外界環境影響較小; 而有的QTL在不同環境中檢測到的位置不穩定, 受環境影響較大。QTL成簇分布現象是指同一條染色體上有多個不同性狀的QTL, 并且這些性狀與相同的標記連鎖或者分布在相同的標記區間。在棉花以及其他作物的研究中[22-25]都已發現控制不同性狀的QTL集中連續分布的現象, 并且認為這可能與多基因連鎖或者一因多效有密切關系。本研究中也發現20個QTL成簇分布。其中, 位于第11染色體的有7個QTL, 位于第15染色體的有6個QTL。這些成簇分布的QTL對于改良棉花纖維品質和產量具有重要意義。

關于棉花纖維品質和產量性狀相關的QTL定位在國內外已有很多報道[26-29]。但是, 在前人研究中難以判斷是否存在與本研究結果一致的QTL, 目前發現一個纖維強度相關的QTL ()與本課題組楊鑫雷等[30]利用的F2:3群體獲得的結果一致, 均位于第9染色體–區間, 推斷可能是同一個QTL。一致性QTL較少的主要原因可能: 一是分子標記種類較多, 不同研究機構選用的標記種類不同; 二是不同研究者選用的親本不同; 三是遺傳圖譜構建工作量較大, 高密度遺傳圖譜較少。本研究使用的海島棉染色體片段置換系群體是一個永久性分離群體, 可以提供大量的種子進行多年多點試驗。根據初步定位結果, 將QTL-CSSLs與輪回親本雜交衍生出F2或F2:3群體, 可用于目標性狀的精細定位[31]。

A3 (C3)、A5 (C5)、A11 (C11)、D7 (C7)、D9 (C9)為遺傳圖譜, V3、V5、V11、V7、V9為物理圖譜。

A3 (C3), A5 (C5), A11 (C11), D7 (C7), and D9 (C9) are genetic map, and V3, V5, V11, V7, and V9 are physical map.

4 結論

該染色體片段置換系群體包含182個家系, 置換片段數在1~15個之間, 平均為6.6個; 導入片段長度在0.7~83.2 cM之間, 平均長度為16.8 cM; 置換片段總長度為20 249.6 cM; 背景回復率在92.3%~99.6%之間, 平均為96.2%。共檢測到59個纖維品質和產量性狀相關的QTL, 其中與纖維品質相關的41個, 單個QTL貢獻率為1.27%~26.66%, 增效基因來源于海島棉Pima 90-53的21個; 與產量性狀相關的18個, 單個QTL貢獻率為2.03%~19.38%, 增效基因來源于陸地棉中棉所8號的9個。檢測到14個馬克隆值、纖維伸長率、鈴重相關的穩定QTL, 均可在多個環境中被檢測到, 其中, 馬克隆值相關的穩定QTL (、;、)和纖維伸長率相關的穩定QTL (、)增效基因均來自高值親本海島棉Pima 90-53, 鈴重相關的穩定QTL (、)增效基因來自高值親本陸地棉中棉所8號。

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Molecular Evaluation for Chromosome Segment Substitution Lines ofand QTL Mapping for Fiber Quality and Yield

LI Chao1,2, LI Zhi-Kun1, GU Qi-Shen1, YANG Jun1, KE Hui-Feng1, WU Li-Qiang1, WANG Guo-Ning1, ZHANG Yan1, WU Jin-Hua1, ZHANG Gui-Yin1, YAN Yuan-Yuan1, MA Zhi-Ying1, and WANG Xing-Fen1,*

1North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan, China

In the previous study, we developed a set of chromosome segment substitution lines (CSSLs) usingCCRI8 as the recipient parent ande Pima 90-53 as the donor parent. In this study, we genotyped the BC3F5generation of CSSLs with SSR markers, conducted QTL mapping for the fiber quality and yield traits and identified the stable QTLs in three different environments (Baoding, Qingxian, Luntai). The substituted segment number of the 182 CSSLs varied from one to fifteen, averaged 6.6. The length of introgressed segments ranged from 0.7 cM to 83.2 cM, and averaged 16.8 cM. The total length of the substituted fragment was 20 249.6 cM, background recoverage rate varied from 92.3% to 99.6%, and the average background recoverage rate was 96.2%. Fifty-nine QTLs related to fiber quality and yield traits were detected. Among them, 41 QTLs were related to fiber quality traits and each QTL explained 1.27% to 26.66% of the phenotypic variation. Eighteen QTLs for fiber yield-traits including boll weight and lint percentage were detected and each QTL explained 2.03% to 19.38% of the phenotypic variation. Fourteen stable QTLs were detected in multiple environments. Among them, four QTLs related to micronaire value and two QTLs related to fiber elongation both had enhancing alleles fromPima 90-53. Two boll weight QTLs had enhancing alleles fromCCRI8. The results provide a theoretical basis for QTL fine mapping, QTL interaction and molecular breeding for fiber quality and yield traits.

upland cotton; sea island cotton; CSSLs; fiber quality; yield; QTL mapping

2017-11-06;

10.3724/SP.J.1006.2018.01114

王省芬, E-mail: cotton@hebau.edu.cn

李超, E-mail: leechao816@163.com

2018-06-12;

2018-06-20.

本研究由國家重點研發計劃項目(2016YFD0101006)和河北省科技支撐計劃項目(16226307D)資助。

The study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0101006) and Hebei Science and Technology Support Program (16226307D).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180620.0000.000.html