間充質干細胞和淋巴細胞分泌細胞因子的抗衰老功效研究

閔 倩，陳雪梅，苗 瀛，吳滌梵，徐 荻

（1.上海薈苒生物科技有限公司，上海，200333；2.上海宇研生物技術有限公司，上海，200333）

干細胞可以分泌大量的細胞因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、干細胞生長因子（SCF）等，這些因子具有對抗氧化應激、修復創傷、調節皮膚色素代謝等作用[1-4]，同時干細胞可以通過旁分泌和細胞接觸調節皮膚真皮干細胞的分化[5]，因此干細胞分泌產物具有抗衰老和美容護膚作用[6]。

機體內細胞因子的主要分泌細胞是淋巴細胞，細胞因子除了對自身細胞發揮調節作用外，還對鄰近的細胞以及遠處的細胞發揮旁分泌和內分泌調節作用，在促進皮膚創傷修復方面已有深入研究[7]。人體天然分泌的細胞因子已發現的達上百種，相互協同發揮作用，如表皮細胞生長因子（EGF）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）、酸性和堿性成纖維細胞生長因子（aFGF、bFGF）、神經生長因子（NGF）等生長因子家族成員，可以定向促進各種細胞的生長，促進細胞間基質的形成，促進皮膚損傷組織的修復[8]。TGF-β轉化生長因子家族，可促進成纖維細胞等組織細胞的生長，促進細胞外基質如膠原蛋白、纖粘連蛋白的表達[9]。基因重組細胞因子已被作為護膚添加劑使用，如重組EGF、bFGF等，但淋巴細胞分泌的天然細胞因子的皮膚抗衰老作用尚未見報道。

本研究從新生兒臍帶血提取單個核細胞擴增的淋巴細胞以及健康產婦羊膜提取擴增的間充質干細胞這兩種細胞中分別提取人天然分泌細胞因子，并對其中bFGF等細胞因子含量、促人成纖維細胞（HFF-1）增殖活性、促膠原蛋白合成能力等方面進行了研究和比較，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

淋巴細胞分離液（GE Health）；bFGF ELISA檢測試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；TGF-β1 ELISA檢測試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；IFN-γ ELISA檢測試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；SCF ELISA檢測試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；人I型膠原ELISA檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；APCCD105流式抗體（BD Bioscience）；FITC-CD90流式抗體（BD Bioscience）；FITC-HLA-DR流式抗體（BD Bioscience）；GT-T551培養基（TaKaRa）；DMEM/F12培養基（Gibco）；IL-2（上海華新生物高技術有限公司）；Ⅳ型膠原酶（Sigma）；慶大霉素（浙江瑞新藥業股份有限公司）；HFF-1細胞（中科院上海生命科學院）；1×PBS溶液（生工，配制滅菌）；通過安全性質檢指標的臍帶血和人羊膜（取樣前與胎盤和羊水提供者簽署知情同意書，知情同意書內容經醫學倫理委員會認證）

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞制備（1）淋巴細胞制備：采集健康產婦的新生兒臍帶血，550-600g離心10min分離出上層血漿，56℃滅活后備用。向下層沉淀中加入等體積1×PBS混勻，經人淋巴細胞分離液密度梯度離心從白膜層分離單個核細胞（PBMC），加1×PBS稀釋，550g離心10min，棄上清。取PBMC細胞接種到GT-T551無血清培養基，調整細胞濃度為 1×106個/ml，添加 IL-2（200U/ml）和5%臍帶血漿，在37℃、5%CO2條件下培養，不同時間收集細胞進行細胞記數，至十八天離心收集培養上清液。

（2）人羊膜間充質干細胞制備及鑒定：取健康產婦的胎盤羊膜，無菌剪剪碎，用0.05%胰酶預處理。按比例向羊膜沉淀中加入Ⅳ型膠原酶，混勻，置于水浴恒溫振蕩器（37℃，75r/min）2小時。待羊膜組織溶解95%以上后終止消化，100 μm細胞篩過濾，390g離心10min。取細胞接種到DMEM/F12完全培養液（含5%FBS慶大霉素50U/ml），調整細胞濃度為 5×105/ml，在37℃、5%CO2條件下培養。每隔二到三天進行細胞傳代并收集第十八天的細胞培養上清。

隨機抽取P0-P6代細胞進行流式鑒定，1×106個細胞加入20μL抗體，4℃孵育30 min，用1×PBS溶液洗去多余流式抗體，棄上清，再用300 μL1×PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.2.2 細胞因子提取將上述兩種培養上清液用1KD超濾膜超濾，去除分子量1000以下的小分子雜質，收集截留液待用，標記為淋巴細胞組和間充質干細胞組。

1.2.3 Elisa檢測用ELISA 試劑盒對超濾后的上清液中bFGF、TGF-β、IFN-γ、SCF以及人I型膠原蛋白含量進行定量檢測，設置空白孔，標準品孔及樣品孔，按試劑盒說明書依次進行上樣孵育、洗板、二次孵育、洗板、顯色、終止和上機檢測操作。以空白孔調零，450nm波長測各孔吸光度，繪制標準曲線以計算樣品中bFGF、TGF-β1、IFN-γ、SCF及人I型膠原蛋白含量。

將對數生長期的HFF-1細胞（來源于中科院上海生命科學院）用無血清培養基DMEM丙酮酸鈉青鏈霉素混合液，調整細胞濃度為4000個/200ul，到96孔板，細胞接種量為4000個/200ul/孔，將細胞提取物按照不同濃度（0%，2%，4%，6%，8%，10%）加到各孔中，設置三復孔，加培養基后培養箱孵育72h觀測，加入CCK-8溶液繼續培養2 h，酶標儀測定細胞于波長450nm處的吸光度值（OD值），以0%孔為對照孔，計算細胞增殖活性增加百分率。計算公式：（OD實驗孔-OD對照孔）/OD對照孔

1.2.5 統計學方法每種細胞分別用相同的方法制備三個批次的提取物，采用SPSS 19.0統計學軟件進行隨機單位組方差分析，兩組間比較用t檢驗。所有數據均用（x ± s）表示，檢驗水準=0.05。

2 結 果

2.1 人羊膜間充質干細胞表型

P3代樣品細胞高表達CD90，CD105抗體，低表達HLA-DR抗體，符合間充質干細胞的表型特征。（圖1-3）

2.2 細胞因子含量

淋巴細胞提取物與間充質干細胞提取物中bFGF的 含 量 分 別 為（18.00±2.59）pg /mL和（16.48±5.04）pg /mL，無明顯差異（p=0.68），TGF-β1含 量 分 別 為（19.54±3.33）pg /mL和（10.07±3.63）pg /mL，IFN-γ 含 量 分 別 為（85.43±13.08）pg /mL 和（56.61±7.66）pg /mL，統計學分析提示淋巴細胞提取物中TGF-β1與IFN-γ含量均高于干細胞提取物，二者差異有顯著 性（pTGF-β1=0.029，pIFN-γ=0.034），SCF含量分別為（21.57±7.62）pg /mL和（38.56±6.08）pg /mL，干細胞提取物中SCF含量顯著高于淋巴細胞提取物（p=0.043）。（圖4）

2.3 人I型膠原蛋白含量

淋巴細胞及間充質干細胞提取物中人I型膠原蛋白含量分別為（37.80±4.48）pg/mL和（35.93±1.58）pg/mL，兩組膠原蛋白含量無明顯差異（P＞0.05）。

2.4 HFF-1細胞形態觀察

顯微鏡下觀察，未添加細胞活性提取物的人皮膚成纖維細胞：細胞數量少，縮短，兩頭分叉，排列紊亂，呈衰老狀態（圖5左）。添加淋巴細胞提取物和間充值干細胞提取物培養的人皮膚成纖維細胞，細胞形態細長，排列有序，呈生長活躍年輕態（圖5 中、右）。

圖1 空白對照

圖2. CD90+ /CD105+率84.63%

圖3. HLA-DR-率0.21%

圖4 淋巴細胞及間充質干細胞提取物細胞因子含量對比圖

2.5 促HFF-1 細胞增殖率

添加細胞提取物后，HFF-1細胞增長率明顯提高，以2%提取物濃度為參照，當兩種細胞提取物濃度從2%增加到4%時，HFF-1增殖率變化不顯著（P＞0.05）。HFF-1細胞增殖率從6%開始顯著上升（P ＜0.01）。淋巴細胞提取物對HFF-1細胞的促進作用略高于干細胞提取物，但兩種細胞提取物對HFF-1細胞增殖的促進效果無明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

皮膚的老化是一個復雜的生物學過程，主要涉及真皮層，如基質金屬蛋白酶水平增加導致細胞間基質（ECM）膠原蛋白和彈性纖維降解增加，TGF-1β信號傳導障礙導致膠原蛋白合成減少等，此外皮下組織血管減少以及結構變化也是皮膚老化的重要因素[10,11]，因此通過補充細胞因子激活真皮層細胞活力在皮膚抗衰老領域有很大的潛力。從多種干細胞主要是間充質干細胞獲得的細胞培養產物已被證實具有皮膚抗衰老功效[12,13,14]。

2013年美國哈佛大學的Loffredo[15]等科學家使用老少配的連體共生動物實驗，將老年小鼠和年輕小鼠的血液進行互相交換，四周后老年小鼠肥大的心臟恢復正常。2015年斯坦福大學Wyss-Coray[16]教授團隊發現在老年小鼠和年輕小鼠經手術縫合連體共生一周后兩只小鼠的淋巴細胞發生了交換，淋巴細胞分泌的活性蛋白可以透過血腦屏障進入大腦，并改善老年小鼠的學習能力和睡眠。由此可見，年輕機體的淋巴細胞可以分泌具有抗衰老作用的細胞活性因子。

本實驗選取新生兒臍帶血和健康產婦羊膜分別提取淋巴細胞和間充質干細胞并制備細胞提取物，選擇生長因子bFGF、SCF、轉化因子TGF-β1、淋巴因子IFN-γ為代表性指標，測定細胞提取物中的細胞因子水平，結果顯示，淋巴細胞提取物含有更高水平的TGF-β1和IFN-γ，干細胞提取物含有更高水平的SCF，二者含有相似水平的bFGF。

對體外培養的HFF-1細胞促增殖以及膠原蛋白合成檢測結果證實，淋巴細胞和干細胞提取物均具有顯著的促進成纖維細胞增殖和促進膠原蛋白合成能力。

圖5 HFF-1未添加活性提取物培養及添加活性提取物培養形態對比圖

圖6 淋巴細胞及間充質干細胞促HFF-1細胞增殖率對比圖

bFGF是一種多功能細胞生長因子，具有調節細胞生長和組織修復作用；干細胞生長因子SCF具有促進各種組織干細胞生長和分化作用；TGF-β1是促進皮膚膠原蛋白合成的重要信號因子；IFN-γ具有免疫調節、抗病毒和抗腫瘤作用，在皮膚病治療領域，除用于抗病毒和細菌感染等皮膚病外，作為一種強有力的抗纖維化因子也被用于瘢痕疙瘩的治療[17]。因此本研究提示臍帶血來源的淋巴細胞與羊膜間充質干細胞相似，均能分泌豐富的細胞因子，具有顯著的皮膚抗衰功效，由于其含有更高水平的TGF-β1和IFN-γ，在抑制炎癥、減少瘢痕形成、修復痘印等方面具有更好的美容應用前景。

由于人體細胞分泌的天然細胞因子含量甚微，難以定量檢測，本研究以bFGF、TGF-β1等細胞因子含量檢測和體外培養 HFF-1細胞促增殖功能檢測相結合，提供了一種細胞提取物中細胞因子的活性評估實驗方法。

天然細胞分泌的活性蛋白多達數百種，這些活性成分構成復雜的細胞因子網絡相互協調發揮保持機體內環境穩定以及抵御疾病的作用，雖然目前的研究還不能鑒定所有的細胞因子作用機制及其如何綜合發揮抗衰老效應，但是從人體細胞獲取的天然細胞因子在抗衰老領域將比單一的細胞因子有更重要的應用價值。