毛細管電泳的離子富集性能研究

(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司,北京 101200)

在分析化學(xué)研究領(lǐng)域，近年來毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE) 是發(fā)展較快的技術(shù)。近些年在一些重大國際研究項目中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[1]。毛細管電泳作為芯片實驗室[2]最重要的基礎(chǔ)技術(shù)之一，在DNA與RNA分析、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、藥物分析等方面都有大量應(yīng)用[3]。

毛細管電泳分析金屬離子簡單快速[4，5]，自20世紀(jì)末以來,毛細管電泳被廣泛的應(yīng)用于無機離子和其他低分子量離子的測定。由于一般的金屬離子不具有光學(xué)活性，對于金屬離子測定,多采用間接紫外檢測法，或者利用毛細管柱上濃縮技術(shù)，通過增加上樣量以提高檢測靈敏度。場增強進樣、電堆積富集及等速電泳等多種模式都屬于柱上濃縮技術(shù)。電堆積富集利用樣品區(qū)帶與載體電解質(zhì)的電阻率不同，使得樣品離子堆積富集在樣品區(qū)帶與運行區(qū)帶邊界處。金屬離子的測定也可以利用X射線熒光, 可以先進行離子富集, 再進行測定。

在線富集是提高毛細管電泳靈敏度的一種有效手段，由于對儀器要求低和操作簡單得到了快速發(fā)展。由于單一富集的方法往往有一定的局限性，為了提高毛細管電泳的靈敏度，可將兩種或多種富集方法聯(lián)用。毛細管電泳在線富集方法研究的另一主要方向是將在線富集方法與高靈敏度檢測技術(shù)相結(jié)合。對復(fù)雜基質(zhì)中痕量及超痕量組分的富集是建立新富集方法的重點。新富集方法需要兼顧重現(xiàn)性高、無需離線預(yù)處理、富集時間短和操作簡單等要求。由于在線富集技術(shù)在不斷的發(fā)展，今后毛細管電泳的檢測靈敏度會有顯著的提高。毛細管電泳在蛋白質(zhì)組學(xué)[6,7]、環(huán)境和食品科學(xué)等分析領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用。檢測手段的提高也進一步拓展了毛細管電泳的應(yīng)用領(lǐng)域，像CE-MS聯(lián)用不僅分離效率高，且能提供結(jié)構(gòu)信息，在疾病的診治[8]及腫瘤的研究中[9]都是重要工具。

目前，從事毛細管電泳技術(shù)與應(yīng)用相關(guān)研究的科研院所、院校均配備商業(yè)化毛細管電泳儀，許多有條件的科研單位均選擇靈敏度更高的熒光檢測系統(tǒng)和全自動化進樣系統(tǒng)。目前分析儀器市場上性能突出的毛細管電泳儀基本為進口儀器(如Agilent、Beckman等)，由于價格昂貴，限制了其進入更多的實驗室。因此開發(fā)高性能、低成本、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)毛細管電泳儀器既能滿足相關(guān)領(lǐng)域更為廣泛的技術(shù)應(yīng)用需求、也能填補國內(nèi)分析儀器在中高端產(chǎn)品的市場空白。

1 原理

1.1 毛細管區(qū)帶電泳

電泳是指電解質(zhì)溶液在電場作用下，其中的帶不同電荷的粒子會以不同的速度朝與其所帶電荷相反的電場方向進行遷移的現(xiàn)象。一般情況下毛細管電泳使用石英材料毛細管，當(dāng)石英毛細管在PH>3時，毛細管的內(nèi)表面會帶負電，而在與其接觸的溶液表面上則會形成一大小相等符號相反的電荷層,于是一雙電層存在于溶液與管壁的界面上。當(dāng)毛細管兩端施加一個高電壓時，雙電層中的水合陽離子層會驅(qū)動溶液整體在毛細管內(nèi)向負極流動，這個溶液的整體流動稱為電滲流。電解質(zhì)溶液中的帶電粒子的電泳和電滲流的矢量就是離子在毛細管內(nèi)的遷移速度。帶電粒子在毛細管中的遷移過程中，帶正電荷粒子的電泳速度和電滲流速度方向相同，在各種粒子中最先流出。中性粒子不受電泳的影響，遷移速度就是電滲流的速度。由于負電性粒子的電泳方向與電滲流的方向相反，運動速度是電滲流與電泳速度之差(一般情況下電滲流速度大于電泳速度)，因此在毛細管電泳中帶負電荷的粒子是最后流出。不同種類的粒子的分離就是利用了不同離子在毛細管電泳中的遷移速度不同而實現(xiàn)的，利用這種分離原理的方法稱為毛細管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis，CZE)。區(qū)帶電泳是毛細管電泳的最常用形式，儀器裝置的組成主要包括毛細管、高壓電源、柱上檢測器和緩沖液貯瓶，兩個緩沖液貯瓶分別在毛細管的兩端且與高壓電源相連，常用電壓一般在數(shù)千伏至數(shù)十萬伏，溫度在25℃左右，檢測器以紫外檢測器為主。

1.2 等速電泳

等速電泳是基于離子淌度差異的一種電泳富集模型，又被稱為“移動邊界”電泳技術(shù)。其樣品在前導(dǎo)和尾隨電解質(zhì)之間被注入。在高電壓的作用下各組分會逐漸分離，隨著組分的分離各組分區(qū)帶的電場也在發(fā)生著相應(yīng)的變化。電導(dǎo)較大的離子電泳遷移速率也較大，但區(qū)帶的電場反而較小，其遷移速率就會逐漸降低。當(dāng)各組分的電泳遷移速率均達到前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移速率相同時達到平衡狀態(tài)，此時溶液出現(xiàn)穩(wěn)態(tài)遷移模式。等速電泳的負載量進樣量比毛細管區(qū)帶電泳高很多，可達μL級。等速電泳對痕量樣品起到很好的濃縮作用，是一種理想的樣品富集技術(shù)。等速電泳非常適用于血樣、尿樣以及環(huán)境樣品等復(fù)雜樣品基質(zhì)的生物樣品體系，應(yīng)用范圍包括荷電小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子。

1.3 色譜富集

固相萃取富集是一種離線樣品前處理方法，在毛細管電泳分離中經(jīng)常使用。該方法是毛細管電泳在線富集的一種新手段，實際上就是在毛細管柱上進行色譜富集。其富集的過程是先將量比較大的低濃度樣品負載到固定相中，再用體積相對較小的洗脫液將樣品洗脫下來，從而得到濃度較高的富集溶液。在分析工作中常見的與毛細管在線聯(lián)用的方法有固相萃取、膜萃取和液相萃取等。但色譜富集方法的缺點是操作時間過長、自動化程度低。

1.4 樣品堆積

在高電壓的作用下，若毛細管中同時存在著低導(dǎo)和高導(dǎo)溶液時,低導(dǎo)溶液區(qū)的電場要比高導(dǎo)溶液區(qū)的電場強度高，低導(dǎo)區(qū)的樣品離子遷移速度要比高導(dǎo)區(qū)的樣品離子遷移速度快。樣品堆積技術(shù)就是利用了這個速度的差別。該方法先將待測樣品溶解于低導(dǎo)溶液中，在高電壓作用下毛細管中的樣品離子向高導(dǎo)的緩沖溶液中運行。樣品離子在越過低導(dǎo)溶液和高導(dǎo)緩沖液交界面時，遷移速度會大幅度的降低,樣品離子速度驟降的結(jié)果導(dǎo)致了樣品區(qū)帶長度的縮短，濃度則相應(yīng)提高，從而達到富集目的。

毛細管電泳在線富集方法中樣品堆積方法是應(yīng)用較為廣泛的方法之一，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于陰、陽離子和混合離子的分離分析。目前主要有壓力進樣和電動進樣兩種樣品堆積方法。采用電動進樣的樣品堆積又被稱為場放大進樣，電動進樣是一種更高效的在線富集方法，具有比壓力進樣更高的濃度檢測靈敏度。

1.5 pH法

常見的pH法有pH調(diào)制堆積和動態(tài)pH聯(lián)接。pH調(diào)制堆積中的酸富集是將樣品用高離子強度的溶液制備并通過電遷移引入毛細管，然后通過電遷移引入一小段強酸溶液。強酸中的質(zhì)子在電動進樣時快速地向樣品區(qū)帶遷移，中和了其中的弱酸根離子，使待測組分變?yōu)殡娭行裕瑢?dǎo)致電中性樣品區(qū)帶的電導(dǎo)率大大降低，使得待測組分在樣品區(qū)帶與背景緩沖溶液的界面處進行堆積，樣品區(qū)帶縮短，樣品濃度增加，從而使靈敏度顯著提高，可以用于高鹽基質(zhì)中痕組分的分析。但毛細管大部分長度用于富集了，用于分離的長度僅占一小部分，會嚴(yán)重影響方法的分離能力。該法對于復(fù)雜組分樣品的測試不利，但非常適合組分簡單的樣品中的痕量組分分析。

1.6 絡(luò)合平衡富集法

金屬離子在進入流動相時，會與其中的絡(luò)合劑發(fā)生絡(luò)合使離子的遷移狀態(tài)發(fā)生驟變而實現(xiàn)離子的富集[10]。在樣品區(qū)帶前端樣品溶液中的金屬離子遷移到初始樣品區(qū)段與運行區(qū)段的邊沿時，與流動相中的絡(luò)合劑絡(luò)合，原來帶正電的離子變?yōu)橹行曰驇ж撾姡娪具w移速率會明顯降低或改變遷移方向；而樣品區(qū)帶后端的帶正電荷金屬離子繼續(xù)遷移，在遇到帶負電荷的絡(luò)合劑離子后發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，在兩相界面堆積從而達到富集的目的。

2 試驗

2.1 試驗器材

毛細管電泳儀：型號Beckman P/ACE System 5010，生產(chǎn)商：美國Beckman公司；熔融石英毛細管50μm，生產(chǎn)商：河北永年光導(dǎo)纖維廠。咪唑(分析純);α-羥基乙酸(分析純);其他有關(guān)試劑均為分析純。

2.2 儀器測驗條件

紫外檢測波長：214nm；試驗溫度：25℃；電泳電壓：20kV；采集頻率：16Hz。

毛細管使用前以1mol/L NaOH溶液、純凈水、緩沖液分別依次沖洗3min。

清洗液：0.1mol/LHCl溶液；0.1mol/LNaOH溶液；純凈水；背景電解質(zhì)：咪唑溶液(10mmol/L)， α-羥基乙酸(10mmol/L)；pH=4.0。

3 結(jié)果與討論

使用毛細管區(qū)帶電泳法對食品中常見的一些指標(biāo)元素進行了探索分析, 發(fā)現(xiàn)背景電解質(zhì)和緩沖液pH值對離子間的分離影響較大。咪唑濃度的增加與離子分離效果成正比，但增強的背景吸收會掩蓋離子峰的強度，如果咪唑濃度過高會影響方法的靈敏度。pH值明顯影響配位平衡，pH值的增加會導(dǎo)致各離子峰的區(qū)分度變差，主要原因是pH值的增加增大了電滲流。增大α-羥基乙酸濃度會增加各離子峰的遷移時間，但太低的濃度不利于各離子峰的區(qū)分。實驗條件需要針對具體情況綜合優(yōu)化，綜合優(yōu)化條件下3種食品中作為重要指標(biāo)元素的金屬離子的毛細管電泳結(jié)果見圖1。

圖1 3種金屬離子電泳圖

對于圖1測定的3種金屬離子，測試結(jié)果給出的檢出限分別為：Cd2+：0.02μg/mL；Pb2+：0.07μg/mL；Cu2+：0.05μg/mL。

根據(jù)試驗得出的線性回歸方程，得到3種金屬離子在CZE測定中的線性范圍為：Cd2+：0.05～20μg/mL；Pb2+：0.12～20μg/mL；Cu2+：0.10～25μg/mL。

精密度試驗給出，在10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合液情況下，3種金屬離子的 RSD(%)(n=7)分別為：Cd2+：2.1；Pb2+：1.1；Cu2+：1.6。

咪唑溶液濃度加大對分離有利，但濃度的增加會使背景吸收加強，有時會降低方法的靈敏度，對檢出限不利。α-羥基乙酸溶液濃度對試驗結(jié)果影響明顯，濃度太高使遷移時間明顯增加并產(chǎn)生較高的焦耳熱，濃度太低會使各離子峰展寬而區(qū)分度變壞。pH值的升高也會使離子峰的區(qū)分度變差，主要是電滲流會隨著pH值的升高而增大。

4 結(jié)語

毛細管電泳是近三十年發(fā)展起來的一種新型富集分離分析技術(shù)，是分析科學(xué)領(lǐng)域繼高效液相色譜之后的又一次革命，是現(xiàn)代微柱分離與經(jīng)典電泳技術(shù)有機的結(jié)合。

背景電解質(zhì)選用10mmol/L咪唑溶液，陽離子的選擇性改性劑使用10mmol/L的α-羥基乙酸作為，電泳條件選擇pH=4.0、分離電壓20kV、分離溫度25℃。幾種金屬離子在15min內(nèi)可得到有效分離，且具有較低的檢出限和良好的線性關(guān)系。

利用毛細管區(qū)帶電泳法,選用適合的背景電解質(zhì)和選擇性改性劑,在優(yōu)化的試驗條件下可以有效解決目前食品衛(wèi)生等領(lǐng)域痕量元素分析的需求。