栽培種花生FAE1基因的克隆和序列分析

張欣 孫全喜 吳琪 王秀貞 胡東青 唐月異 王志偉 宋國生 徐建志 殷冬梅 王傳堂

摘要：脂肪酸鏈延長酶1（FAE1）是控制脂肪酸延長的關鍵酶，對芥酸的生物合成有至關重要的作用。本研究從栽培種花生的兩個染色體組中分別克隆得到2個FAE1基因，命名為FAE1-A和FAE1-B。FAE1只有一個開放閱讀框，無內含子，完整編碼區長1 536 bp，編碼511個氨基酸。利用相關軟件或在線工具對FAE1進行生物信息學分析，結果表明其編碼蛋白二級結構以α螺旋為主；無信號肽，表明FAE1蛋白不是分泌蛋白，而是在細胞中發揮作用，且主要存在于內質網上；FAE1蛋白不穩定系數小于40，總平均親水系數為負數，屬于不穩定的親水性蛋白。本研究可為花生低芥酸育種提供依據。

關鍵詞：FAE1；芥酸；花生；基因克隆；生物信息學分析

中圖分類號：S565.2：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0035-06

Abstract Fatty acid elongation 1 （FAE1） is a key enzyme that controls the elongation of fatty acids and plays a crucial role in the biosynthesis of erucic acid. In this study， two FAE1 genes， FAE1-A and FAE1-B， were cloned from two genomes of the cultivated peanut， respectively. FAE1 had only one open reading frame， no introns， and the complete coding sequence of the gene is 1 536 bp， encoding 511 amino acids. The bioinformatics analysis results showed that the secondary structure of FAE1 protein was mainly α-helix； there was no signal peptide， indicating that FAE1 was not secretory protein， and it worked in cells and mainly existed in endoplasmic reticulum； the instability coefficient of FAE1 was lower than 40 and the total mean hydrophilic coefficient was negative， so FAE1 was unstable hydrophilic protein. The study may facilitate peanut breeding for low erucic acid content.

Keywords FAE1； Erucic acid；Peanut； Gene cloning； Bioinformatics analysis

芥酸（C22∶1）是一種常見于十字花科植物種子中的長鏈脂肪酸，不易被人體消化吸收。試驗證明，芥酸積累會引起心肌脂肪沉淀并導致心肌脂肪代謝障礙，嚴重危害健康[1-3]。因此，低芥酸含量已成為食用油品質的一項重要指標。

FAE1是控制脂肪酸碳鏈延長的關鍵基因[4]。該基因所編碼的酶是長鏈脂肪酸合成過程的限速酶，決定了脂肪酸碳鏈的長度[5]。現已從擬南芥、甘藍型和芥菜型油菜等植物中克隆到該基因[6-8]，雖然不同材料中FAE1基因在長度與序列上存在差異，但均無內含子[9]。目前已將擬南芥FAE1基因轉化到酵母、擬南芥、煙草和油菜中，FAE1的表達能使酵母和煙草的長鏈脂肪酸積累，且擬南芥和油菜基因組中FAE1拷貝數的增多使長鏈脂肪酸含量明顯升高[4]。

花生含有豐富的蛋白質和脂肪，是我國主要的油料作物之一。據報道，有的花生品種（系）芥酸含量超出我國花生油國標（≥0.3%）[10]。本研究旨在克隆花生栽培種FAE1基因，為花生低芥酸遺傳育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

栽培種花生F112-2（C1×FB4雜交后代）。

1.2 基因完整編碼區獲取

查找PeanutBase（https：//www.peanutbase.org/home）獲取二倍體野生種Arachis duranensis和A. ipaensis的FAE1編碼區序列，其在PeanutBase中的ID分別是Aradu.RBU21和Araip.YN0DS。

1.3 引物設計

根據野生種A. duranensis和A. ipaensis的FAE1序列，利用Primer Premier 5.0軟件分別設計引物，經過PCR引物篩選確定最終引物（表1）。

1.4 PCR擴增、克隆測序與序列比對

PCR反應體系（50 μL）：PrimesSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，正反向引物各2 μL，模板2 μL，5×PA GXL Buffer 10 μL，2.5 mol/L dNTP 4 μL，加ddH2O補足體系。反應程序：94℃預變性1 min，98℃變性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸2 min，共30個循環，結束反應。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。目的條帶切膠回收后進行連接轉化，FAE1-A和FAE1-B各挑取3個陽性單克隆送華大基因公司測序。利用DNAStar軟件的Megalign組件將得到的栽培種FAE1-A和FAE1-B序列與野生種A. duranensis和A. ipaensis FAE1序列以及美國PeanutBase和福建農林大學（http：//peanutgr.fafu.edu.cn/）發布的栽培種FAE1序列進行比對。

1.5 花生FAE1的生物信息學分析

利用DNAStar軟件的EditSeq組件，分析蛋白分子量，酸性氨基酸、堿性氨基酸、疏水性氨基酸、極性氨基酸的含量，等電點等理化性質；利用NPS@中SOPMA預測蛋白質二級結構。通過NCBI的BLASTP（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）功能分析基因的保守域。利用在線生物信息學軟件ExPASy的ProScale （http：//web.expasy.org/protscale/）對該基因編碼的蛋白進行親/疏水性分析。利用 signalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對該基因編碼蛋白的信號肽進行預測。通過生物信息學軟件PSORT Ⅱ（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對基因編碼蛋白進行亞細胞定位預測。利用生物序列分析中心網站（Center for Biological Sequence Analysis，網址http：//www.cbs.dtu.dk）的TMHMM-2.0軟件對該基因編碼蛋白進行跨膜域預測。利用CBS的Protfun2.2 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）在線生物信息學軟件對該基因編碼的蛋白進行功能預測。利用MEGA7.0軟件采用NJ法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 栽培種花生FAE1編碼區序列的克隆

以栽培種花生F112-2 DNA為模板，使用篩選出的FAE1引物，經PCR各擴增出一條1.8 kb左右的片段（圖1）。根據花生數據庫所獲二倍體野生種A. duranensis和A. ipaensis的FAE1完整編碼區均為1 536 bp，本研究從栽培種花生中克隆得到的FAE1-A和FAE1-B完整編碼區也均為1 536 bp，編碼511個氨基酸。

將FAE1-A、FAE1-B、A. duranensis和A. ipaensis FAE1的核苷酸和氨基酸序列進行比對，發現核苷酸序列的第101、318、356、1 013、1 238、1 280、1 473位和1 520位A、B基因組之間存在差異，第919位栽培種與野生種存在差異，第1 480位栽培種FAE1-A與其他序列存在差異；氨基酸序列的第106位和491位A、B基因組之間存在差異，第306位栽培種與野生種存在差異，第493位栽培種FAE1-A與其他序列存在差異（圖2、圖5）。同時將FAE1-A和FAE1-B與PeanutBase中的Tifrunner品種和福建農林大學發布的花生栽培種序列進行了比對，結果表明FAE1-A和FAE1-B與Tifrunner品種中分別對應的兩條序列比對相似性均為100%；與福建農林大學發布的一條序列比對相似性分別為98.64%和99.22%（圖2）。

2.2 栽培種花生FAE1的生物信息學分析

2.2.1 栽培種花生FAE1編碼蛋白的氨基酸序列分析 對FAE1-A和FAE1-B基因編碼的蛋白質進行物理化學性質分析，結果顯示： FAE1-A蛋白的理論分子量為57.03 kD，理論等電點為9.24，脂溶指數為95.56，總平均親水系數為-0.037。FAE1-B蛋白的理論分子量為56.97 kD，理論等電點為9.24，脂溶指數為94.79，總平均親水系數為-0.041。

FAE1-A蛋白含有的511個氨基酸殘基中，Leu（L）含量最高，占氨基酸總數的11.0%；其次為Val（V）、Ser（S）、Gly（G），分別占氨基酸總量的7.6%、 7.4%和6.8%。含有41個帶負電的氨基酸殘基（Asp + Glu），占總數的8.0%；56個帶正電的氨基酸殘基（Arg + Lys），占總數的11.0%。在大腸桿菌中的半衰期為>10 h，不穩定系數為35.06，屬于不穩定的蛋白質類型。

FAE1-B蛋白含有的511個氨基酸殘基中，Leu（L）含量最高，占氨基酸總數的10.8%，其次為Val（L）、Ser（S）、Gly（G），分別占氨基酸總量的7.8%、7.4%和6.8%。含有41個帶負電的氨基酸殘基（Asp + Glu），占總數的8.0%；56個帶正電的氨基酸殘基（Arg + Lys），占總數的11.0%。在大腸桿菌中的半衰期為>10 h，不穩定系數為35.70，屬于不穩定的蛋白質類型。

2.2.2 栽培種花生FAE1結構域分析 應用NCBI的BLASTP分析FAE1-A和FAE1-B的保守結構域，都位于15～510個氨基酸之間（圖3、圖4）。

2.2.3 栽培種花生FAE1編碼蛋白的二級結構分析 通過分析預測蛋白質的二級結構，顯示FAE1-A蛋白中α螺旋占32.88%，無β折疊，轉角構象10.18%，無規卷曲占31.31%；FAE1-B蛋白中α螺旋占32.88%，無β折疊，轉角構象9.78%，無規卷曲占31.70%。

2.2.4 栽培種花生FAE1編碼蛋白的信號肽、亞細胞定位和跨膜域預測 預測結果表明該基因編碼蛋白沒有信號肽；在第38至第60位氨基酸和第80至第102位氨基酸分別構成了2個跨膜結構域；亞細胞定位在內質網上的蛋白占44.4%，定位在細胞質膜、高爾基、分泌系統的囊泡、線粒體、細胞外的蛋白均占11.1%。

2.3 同源基因氨基酸序列比對與進化樹構建

利用DNAMAN軟件將栽培種花生FAE1-A和FAE1-B的氨基酸序列與油菜、擬南芥、黃連木等10種不同作物FAE1的氨基酸序列比對，結果如表2、圖5所示，構建的不同物種FAE1氨基酸序列系統進化樹如圖6所示。可以看出，栽培種花生FAE1-A、FAE1-B與野生種花生A. duranensis、A. ipaensis FAE1同源序列最相似，在進化樹上各組成一個分支。

3 小結

本研究從栽培種花生中成功克隆出FAE1基因FAE1-A和FAE1-B，分別對應于栽培種花生二倍體祖先種A. duranensis和A. ipaensis的FAE1基因，其長度均為1 536 bp，均編碼511個氨基酸，且均無內含子。將FAE1-A和FAE1-B與PeanutBase中的Tifrunner品種和福建農林大學發布的花生栽培種序列比對，發現它們之間有極高的相似性。對這兩個基因進行生物信息學分析，結果表明其編碼蛋白二級結構以α螺旋為主；無信號肽，表明FAE1蛋白不是分泌蛋白，而是在細胞中發揮作用，且主要存在于內質網上；FAE1蛋白不穩定系數小于40，總平均親水系數為負數，屬于不穩定的親水性蛋白。下一步將克隆不同芥酸含量花生的FAE1-A和FAE1-B基因，尋找相關功能標記，為通過分子標記輔助選擇技術培育低芥酸花生品種創造條件。

參 考 文 獻：

[1] 張立實，譚茵，歐陽雁麗，等. 高芥酸菜籽油對大鼠肝組織脂肪酸氧化功能的影響[J]. 營養學報，1991，13（2）：108-113.

[2] 雷紅，蔡亮亮，操麗麗，等. 菜籽油中芥酸含量對小鼠食用安全性的影響[J]. 食品科學，2010，31（19）：321-324.

[3] 焦紅兵. 心臟病人少食菜籽油[J]. 農業科技與信息，2006（4）：47.

[4] Millar A A， Kunst L. Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme[J]. The Plant Journal， 1997， 12（1）： 121-131.

[5] Kunst L， Taylor D C， Underhill E W. Fatty acid elongation in developing seeds of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiol. Biochem.， 1992， 30（4）： 425-434.

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[10]國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 1534—2003 花生油[S].2003-11-11.