Q熱疫苗研究

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Q熱(Q fever)為世界性分布的一種重要人獸共患病，分為急性和慢性兩種類型。急性Q熱主要臨床表現為發熱、頭痛、肌肉酸疼，常并發肺炎、肝炎、心肌炎、甚至腦膜腦炎。急性Q熱未完全治愈可發展為慢性Q熱[1]。貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)為Q熱病原體，一種專性吞噬細胞內寄生的嗜酸性革蘭陰性小球桿菌。貝氏柯克斯體具有感染力強、氣溶膠傳播、理化因素抵抗強、易于儲存等特點，已被有關國際組織認定為重要生物戰劑和生物恐怖劑[2]。

貝氏柯克斯體能夠引起家畜(特別是牛羊)感染，感染的家畜(特別是孕畜和產奶畜)為人類Q熱暴發流行的最主要的傳染源[3]。2007-2010年，荷蘭多家農場暴發羊群貝氏柯克斯體感染，并引發人群Q熱大暴發。荷蘭Q熱大暴發更加使人們認識到Q熱暴發流行對現代社會嚴重危害以及加強Q熱預防重要性。

預防Q熱最有效手段是疫苗接種。為了對付外來貝氏柯克斯體生物武器/生物恐怖劑的攻擊，以及為預防貝氏柯克斯體對人和家畜的自然感染，美國、澳大利亞、俄羅斯、捷克、荷蘭等國家進行了Q熱疫苗研究[2-4]。我國為畜牧業生產大國，很多地區存在牛、羊的貝氏柯克斯體感染，人的貝氏柯克斯體感染在我國也普遍存在。因此，我國有必要研發Q熱疫苗以應對可能發生的Q熱暴發。

1　滅活貝氏柯克斯體

1965年，前蘇聯研制了口服減毒Q熱疫苗(M-44)，由于它能夠在體內長期存活，毒性恢復可能性使得它不能用于對人免疫[4]。1989年，澳大利亞學者采用甲醛滅活I相貝氏柯克斯體(Henzerling株)生產滅活Q熱疫苗(Q-Vax)，Q-Vax是目前世界上唯一獲得藥監部門批準文號的人用Q熱疫苗，在澳大利亞已經用于畜牧業和屠宰業的Q熱易感人群的預防接種10多年，免疫保護效能幾乎為100%[5]。但是，由于Q-Vax接種動物引起發熱、肝、脾損傷，接種人引起局部紅腫和形成硬結等，特別是它可引起Q熱抗體陽性者嚴重全身反應，因此需要篩選接種人群[5-7]。

滅活II相貝氏柯克斯體免疫也能誘導機體產生特異性免疫，但是不能有效抵抗I相貝氏柯克斯體感染。I相貝氏柯克斯體為強毒株，II相貝氏柯克斯體為弱毒株，I相菌株具有完整的I相脂多糖并能夠誘導機體產生I相和II相特異性抗體，II相菌缺乏完整的脂多糖，僅能誘導機體產生II相特異性抗體[8]。Peng等[9]研究證明I相脂多糖特異抗體或單克隆抗體能夠有效地中和I相貝氏柯克斯體，阻止其對巨噬細胞的入侵。

2　化學提取組分疫苗

上世紀80年代末， Williams等采用氯仿—甲醇提取I相貝氏柯克斯體(Nine Mile株)，獲得提取后的組分(chloroform-methanol residual, CMR)做疫苗[7]。采用CMR接種的小鼠、豚鼠、猴、志愿者，攻毒試驗證明CMR免疫效果與Q-Vax相當，但局部和全身不良反應顯著減輕[6-7]。王錫樂等[10-11]采用中國分離I相貝氏柯克斯體(新橋株)研制出CMR疫苗；免疫動物實驗證明其具有用新橋株制備的滅活疫苗一樣好的免疫保護效能，其免疫副作用則顯著低于滅活疫苗。孫長儉等[12]采用高壓氣相色譜分析新橋株制備的CMR疫苗和滅活疫苗，發現滅活疫苗經氯仿-甲醇提取后，能夠除去多種脂肪酸和顯著減少某些脂肪酸含量，這些脂肪酸的消除與減少可能是CMR疫苗誘導的局部和全身不良反應消失或減輕的主要原因。

上世紀70年代初，前捷克斯洛伐克學者采用三氯醋酸提取I相貝氏柯克斯體，獲得可溶性三氯醋酸提取物(trichloroacetic acid extract)。化學分析顯示三氯醋酸提取物含有蛋白和脂多糖，凝膠電泳和質譜分析從中鑒定39個蛋白，其中15個為免疫原性蛋白[13]。用三氯醋酸提取物免疫小鼠和兔，免疫動物產生貝氏柯克斯體I和II相抗體以及特異性細胞免疫應答。采用三氯醋酸提取物對1 700多人進行免疫，證明其有良好的免疫保護效能但沒有明顯副作用[13]。

3　貝氏柯克斯體重組蛋白抗原

Zhang等[14]采用分子生物學技術克隆和表達了貝氏柯克斯體主要表面抗原，包括27 kD Com1、30 kD P1、34 kD SP34、60 kD熱休克蛋白B(HspB/GroEL)等。Deringer等[15]采用Q熱患者血清做貝氏柯克斯體(Nine Mile株)免疫蛋白質組分析，總共鑒定14個免疫優勢蛋白抗原，其中8個為I相和II相菌共有蛋白(EF-Tu、GplK、Mdh、DnaK、EF-Ts、SucD、SucB、Com1)，2個I相菌特有蛋白(YbgF I和AhpC/Tsa I)和4個為II相菌特有蛋白(Peptidase M20A family、Rph RNase、Arabinose-5-phosphate isomerase、Hypothetical exported protein)。熊小路等[16]用貝氏柯克斯體感染小鼠血清和Q熱患者血清對貝氏柯克斯體(新橋株)做免疫蛋白質組分析，鑒定7個免疫優勢蛋白抗原(GroEL、YbgF、RplL、Mip、OmpH、Com1、Dnak)。王錫樂等[17]依據貝氏柯克斯體全基因組序列，克隆和表達貝氏柯克斯體毒力和毒力相關基因，制備了104個貝氏柯克斯體毒力和毒力相關重組蛋白，并用這些重組蛋白構建了貝氏柯克斯體蛋白芯片。用貝氏柯克斯體感染小鼠血清從蛋白芯片中篩選出16個血清學反應強陽性蛋白抗原(HspB、Kate、GacA、ApaH、MgsA、SecA、BipA、Lo1A、Ihf-β、Ank4、SecB、Ank2、AhpC-Ts2、EnhA、IcmO、Com1)。焦俊等[18]采用生物素-鏈親和素親和層析以及蛋白質組學技術分離鑒定37個貝氏柯克斯體表面蛋白，并制備出一張含30個貝氏柯克斯體表面蛋白的蛋白芯片；用貝氏柯克斯體感染小鼠血清和Q熱患者血清分析該蛋白芯片，結果23個表面蛋白與半數以上的貝氏柯克斯體感染小鼠4周血清反應陽性，其中15個表面蛋白與半數以上的Q熱患者血清反應陽性。

血清學反應陽性蛋白能夠誘導機體免疫應答產生特異性抗體，因此采用這些陽性蛋白免疫動物，然后用I相貝氏柯克斯體毒株攻擊免疫小鼠，以便發現能夠給予機體特異性免疫保護的保護性抗原。張晶波等[19]建立了貝氏柯克斯體感染BALB/c小鼠動物模型以及檢測貝氏柯克斯體的熒光定量PCR，使評價各種免疫原的抗貝氏柯克斯體免疫保護效能更簡便和準確。熊小路等[20]將GroEL、Mip、Com1等重組蛋白體外刺激BALB/c小鼠骨髓源樹突細胞(murine bone marrow-derived dendritic cells， BMDC)，然后將不同抗原刺激的BMDC分別經腹腔注入正常BALB/c小鼠，攻毒結果顯示Mip或Com1刺激BMDC受體小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于對照，首次證明外膜蛋白Mip和Com1能夠激活樹突狀細胞、誘導機體產生有效的抗貝氏柯克斯體免疫應答。

尉雁等[21]研究證實滅活II相貝氏柯克斯體比I相貝氏柯克斯體能更有效激活BMDC，接受II相激活BMDC小鼠的抗貝氏柯克斯體感染能力明顯強于I相菌激活BMDC受體小鼠，證明脂多糖缺陷II相菌暴露的表面蛋白能夠有效激活BMDC，激活BMDC再將T細胞等免疫活性細胞激活。尉雁等[21]將貝氏柯克斯體3個重組蛋白抗原(Com1、SecB、EnhA)分別刺激BMDC，結果Com1或SecB刺激BMDC受體小鼠能有效抵抗貝氏柯克斯體感染，而EnhA刺激BMDC受體小鼠則不能。他們進一步發現保護性抗原Com1或SecB激活BMDC的能力顯著強于EnhA，能夠誘導BMDC產生高水平IL-6和IL-12p40和低水平的IL-10，從而驅使CD4+T細胞向Th1(IFN-γ)和Th17細胞而不向Th2(IL-4)和Treg細胞分化。王穎等[22]研究發現保護性抗原Com1能有效激活人樹突狀細胞，激活樹突狀細胞則能激活抗原特異T細胞，使其朝著Th1 和Tc1分化。

熱休克蛋白能增強抗原遞呈細胞對抗原的處理和遞呈，有效激活樹突狀細胞、巨噬細胞、NK細胞、特別是抗原特異T細胞，從而產生多種細胞因子去激活和調節先天性和獲得性免疫應答[23]。李青鳳等[24]采用分子克隆技術制備出貝氏柯克斯體P1蛋白抗原與熱休克蛋白HspB的融合蛋白(P1-HspB)。用P1-HspB融合蛋白免疫BALB/c小鼠，攻毒后發現其免疫保護效能顯著好于單獨P1蛋白抗原免疫，提示熱休克蛋白HspB的融合能夠顯著提升P1蛋白抗原的免疫保護效能。進一步分析發現P1-HspB融合蛋白誘導小鼠產生的特異性抗體水平顯著高于P1蛋白，其免疫小鼠的脾淋巴細胞增殖水平以及脾細胞分泌的IL-2和IFN-水平均顯著高于P1蛋白抗原單獨免疫[10]。

4　貝氏柯克斯體T細胞表位

對滅活I相貝氏柯克斯體疫苗的免疫保護機制研究發現，I相貝氏柯克斯體誘導的體液免疫在控制貝氏柯克斯體早期感染起重要作用，但是如果貝氏柯克斯體侵入宿主細胞，宿主細胞內的貝氏柯克斯體清除則依賴T細胞介導的特異性免疫應答[8,25]。機體T細胞介導的特異性免疫應答依賴貝氏柯克斯體的CD4+和CD8+T細胞表位誘導。

4.1CD4+T細胞表位 Chen等[26]從貝氏柯克斯體免疫優勢蛋白抗原中篩選出CD4+T細胞優勢表位。熊小路等[27]通過T細胞表位在線預測軟件分析貝氏柯克斯體7個免疫優勢蛋白抗原(Com1、GroEL、Mip、OmpA、OmpH、P1、YbgF)的H2-Ab限制型CD4+T細胞表位，預測出121條15個氨基酸長的CD4+T細胞表位。將人工合成的121條CD4+T細胞表位肽分別與同源重組蛋白免疫小鼠的CD4+T細胞共孵育，然后用酶聯斑點(ELISPOT)法評價它們誘導致敏CD4+T細胞表達IFN-γ的能力。ELISPOT分析篩選出22條能夠誘導致敏CD4+T細胞分泌高水平IFN-γ的免疫優勢CD4+T細胞表位肽。將這22條免疫優勢CD4+T細胞表位肽再分別刺激貝氏柯克斯體全菌抗原免疫小鼠CD4+T細胞，經ELISPOT評價從中篩選出7條源自不同蛋白抗原的免疫優勢CD4+T細胞表位肽。

熊小路等[27]將這7條免疫優勢CD4+T細胞表位肽單獨或聯合刺激貝氏柯克斯體全菌免疫小鼠脾細胞，用流式細胞術分析脾細胞中CD4+T細胞的IFN-γ和TNF-α表達。結果顯示7條免疫優勢CD4+T細胞表位肽均能誘導高比例CD4+T細胞表達IFN-γ。此外，這7條免疫優勢CD4+T細胞表位肽聯合誘導CD4+T細胞表達IFN-γ的水平顯著高于單條表位肽，提示多條免疫優勢表位肽聯合激活CD4+T細胞的效能顯著好于單個表位肽。將這7條免疫優勢CD4+T細胞表位肽單獨或聯合免疫C57BL/6小鼠，攻毒結果顯示CD4+T細胞表位肽聯合免疫小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于單個表位肽，證明多條免疫優勢CD4+T細胞表位肽聯合免疫效果顯著好于單條肽[27]。

4.2CD8+T細胞表位 熊小路等[28]通過T表位在線預測軟件分析貝氏柯克斯體的24個分泌蛋白和6個免疫優勢外膜蛋白的CD8+T細胞表位，預測出157條H2-Kb、Db限制型9氨基酸長的CD8+T細胞表位。將人工合成的157條CD8+T細胞表位肽分別刺激貝氏柯克斯體感染小鼠CD8+T細胞，通過ELISPOT分析篩選出29條能誘導致敏CD8+T細胞分泌高水平IFN-γ的免疫優勢表位肽；隨后將這29條免疫優勢表位肽分別刺激貝氏柯克斯體感染小鼠CD8+T細胞，流式細胞術分析顯示這些免疫優勢表位肽均能誘導CD8+T細胞表達IFN-γ[28]。

4.3李斯特疫苗菌表達CD8+T細胞表位肽 將單核細胞增生性李斯特桿菌(Listeria monocytogenes，LM)2個與感染以及自身擴散相關的天然毒力因子Internalin B和Act A敲除，構建出不引發機體感染的LM疫苗菌。LM具有細胞內長生命周期和強靶向樹突狀細胞能力，可誘導機體產生強烈的細胞免疫應答[29]。熊小路等[28]將29條貝氏柯克斯體免疫優勢CD8+T細胞表位基因串聯后與表達質粒重組，重組表達質粒轉化LM疫苗菌制備出表達貝氏柯克斯體CD8+T細胞表位的LM疫苗菌(LM-Cb)。用LM-Cb免疫C57BL/6小鼠，攻毒結果顯示LM-Cb免疫小鼠的貝氏柯克斯體載量顯著低于空質粒轉化LM疫苗菌免疫小鼠或非免疫小鼠，證明LM-Cb能夠誘導機體產生有效抗貝氏柯克斯體免疫應答[29]。

5　結　語

由于貝氏柯克斯體是專性細胞內寄生菌，不管是滅活還是化學提取Q熱疫苗，均需要用雞胚大量培養貝氏柯克斯體，然后在高等級生物防護實驗室內采用復雜步驟從雞胚中提取、純化貝氏柯克斯體，這些使Q熱疫苗的生產成本高啟且難以工廠化生產。近十多年來，國內外有關學者著力研究分子Q熱疫苗，已經從研究貝氏柯克斯體保護性抗原轉移到研究誘導特異性細胞免疫應答的T細胞表位上，期望貝氏柯克斯體CD4+和CD8+T細胞表位在體內高效表達，誘導機體產生良好的抗Q熱免疫應答。

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