樣本資源庫中肝病患者和HIV感染者外周血單個核細胞分離效果比較

孫堅萍，高夢丹，覃 嶺，代艷超，喬桂芳，張永宏

轉化醫(yī)學是目前醫(yī)學研究中的重點和熱點，而樣本資源庫作為轉化醫(yī)學研究中的基石和重要組成部分，在疾病預防、個體化治療上發(fā)揮著越來越重要的作用[1-2]。2009年，北京市科委正式啟動疾病資源庫項目建設工作。北京佑安醫(yī)院以肝炎、艾滋病等傳染病人群為主體，建立了肝炎/艾滋病傳染病樣本資源庫[3-6]。

在肝炎/艾滋病傳染病樣本資源庫中，外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是樣本資源庫儲存的重要樣本。從生物樣本中提取PBMC是下游分析方法的必要前導環(huán)節(jié)之一。PBMC包括B細胞、T細胞、自然殺傷細胞、單核細胞等，在評價免疫反應中至關重要[7]，在疫苗研究[8-9]和臨床試驗[10-11]中也具有重要意義。這些后續(xù)的科學研究依賴于高質量的PBMC。本研究對樣本資源庫中肝病患者和HIV感染者這2組人群PBMC分離后細胞數(shù)量和細胞活力進行了檢測分析，對從不同患者標本中提取PBMC有一定的借鑒意義，也為潛在的樣本資源庫質控的標準操作規(guī)程的制定提供了科學基礎和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院2017年7月至2017年8月的標本，標本來源者均已簽署知情同意書。根據(jù)疾病診斷分為肝病患者(乙型肝炎)、HIV感染者和正常對照(健康體檢者)共121例，包括肝病患者35例[男18例，女17例，年齡(37.60±2.24)歲]，HIV感染者51例[男50例，女1例，年齡(33.80±1.29)歲]，對照35例[男8例，女27例，年齡(31.54±1.04)歲]。所有標本均為當天采集新鮮抗凝血，無手術期患者、無凝血等影響分離效果的標本。標本收集后立即進行PBMC的分離。

1.2 PBMC細胞分離 采集EDTA抗凝(貨號367525，美國BD公司)外周血，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液(貨號AS1114546，挪威Axis-Shield公司)密度梯度離心法分離PBMC。 即將外周血離心后在距白細胞層5 mm左右停止血漿提取，使用無菌吸管向剩余標本中加入等體積RPIM-1640(貨號SH30809.01B，美國Hyclone公司)培養(yǎng)基稀釋，顛倒混勻；使用無菌吸管或滴管將上述稀釋后血液小心的加入裝有淋巴細胞分離液的離心管中(操作應輕緩，保持血液與淋巴細胞分離液界面清晰，避免混合)。標本置于離心機室溫離心2 200 rpm 20 min。離心完畢后棄上清液，提取PBMC于離心管中，并加入適量RPIM-1640培養(yǎng)基混合均勻，進行細胞計數(shù)。其余細胞離心后凍存，存儲于樣本資源庫中。

1.3 細胞計數(shù) 采用吖啶橙(acridineorange,AO)/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染液(貨號CS2-0106-5ML，美國Nexcelom公司)對細胞進行計數(shù)，AO為浸潤性染料(膜通透性)，可侵入活細胞與雙鏈DNA結合發(fā)出綠色熒光、與單鏈DNA(變性DNA)結合發(fā)出紅色熒光；PI為排斥性染料(膜不通透性)，不能進入活細胞，與死亡或正在死亡(膜通透性改變)的細胞的核酸結合，發(fā)出紅色熒光。AO/PI雙染色可以區(qū)分活細胞與死細胞。用細胞計數(shù)儀(Cell Counter，美國Nexcelom公司)進行細胞計數(shù)。即取20 μL細胞懸液，與AO/PI染料按1 ∶ 1比例混勻；取20 μL混勻液加入到細胞計數(shù)板(貨號SD100，美國Nexcelom公司)中；將加入混勻液的細胞計數(shù)板插入到自動細胞計數(shù)儀中，計數(shù)活細胞數(shù)、總細胞數(shù)和細胞活性。

1.4 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學分析和作圖均使用GraphPad Prism 6.0軟件。3組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用非配對t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PBMC分離效果與患者年齡的相關關系 對121例樣本PBMC細胞分離后細胞濃度和患者年齡進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)分離后活細胞濃度與年齡相關性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，分離后總細胞濃度和年齡相關性也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，圖1。

A：活細胞濃度和年齡

B：總細胞濃度和年齡圖1 細胞濃度和年齡間的相關性分析

2.2 不同人群PBMC分離效果比較 對3組人群PBMC細胞分離效果進行分析，分離后總細胞數(shù)濃度結果顯示對照組分離細胞最多(1.54×106，9.03×105～3.53×106)，其次為HIV感染者人群(1.08×106，3.72×105～2.82×106)，最后為肝病患者(8.49×105，3.61×105～2.30×106，圖2B)，3組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

分析活細胞結果顯示對照組分離后活細胞濃度最高(1.53×106，8.79×105～3.51×106)，其次為HIV感染者人群(1.06×106，3.46×105～2.77×106)，最后為肝病患者(8.44×105，3.54×105～2.25×106，圖2A)，3組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

分析分離后的細胞活性(圖2C)，發(fā)現(xiàn)對照組細胞活性(98.40±0.39)高于肝病患者(97.28±0.33)和HIV感染者(96.86±0.37)，3組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 不同人群PBMC細胞分離效果比較

2.3 根據(jù)性別分組不同人群PBMC細胞分離效果比較 因為HIV感染者中50例為男性而且年齡偏低，在上述分組時性別和年齡在組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。為排除性別和年齡的影響，根據(jù)性別進行分組并剔除55歲以上的人群，對滿足條件的13例肝病患者，50例HIV感染者，8例對照進行PBMC分離后活細胞濃度、總細胞濃度和細胞活性的比較。結果發(fā)現(xiàn)在全部是男性的人群中，3組人群之間在PBMC分離方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2，圖3)。對照組在活細胞濃度和總細胞濃度方面最高，其次為HIV感染者，最后為肝病患者。而細胞活性也是對照組高于肝病患者和HIV感染者。另外，對女性人群進行分組分析(因HIV感染者只有1例，未進行分析)，17例肝病患者和27例正常對照之間進行PBMC分離后活細胞濃度、總細胞濃度和細胞活性的比較，也發(fā)現(xiàn)肝病患者分離效果低于正常對照組(P<0.05，表3，圖4)。結果顯示對照組分離后活細胞濃度和總細胞濃度均高于肝病患者。細胞活性雖然正常對照組也高于肝病患者，但無統(tǒng)計學意義。

表1 3組人群基本臨床資料和PBMC分離效果比較

注：3組性別、年齡、活細胞、總細胞比較，均P<0.05

表2 55歲以下男性PBMC分離效果比較

注：3組活細胞、總細胞比較，均P<0.05

表3 55歲以下女性PBMC分離效果比較

注：2組活細胞、總細胞比較，均P<0.05

圖3 男性人群中不同分組人群PBMC細胞分離效果比較

圖4 女性人群中不同疾病人群PBMC細胞分離效果比較

3 討論

佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫在建庫時，對比國內(nèi)外疾病資源庫的建設狀況，借鑒和吸收國際生物和環(huán)境樣本庫協(xié)會、世界經(jīng)濟合作與發(fā)展組織以及IS0 9001-2008質量標準的相關要求進行建庫。目前佑安醫(yī)院傳染病資源庫已成為國際生物和環(huán)境樣本庫協(xié)會會員，同時也通過了ISO9001質量認證。在佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫中，PBMC會涉及到后續(xù)細胞培養(yǎng)等實驗，因此，所有標本在處理過程中，無論是否涉及傳染性疾病，均在二級生物安全柜內(nèi)進行，處理人員按照二級防護要求穿戴隔離衣、口罩、帽子、手套等。涉及傳染病的標本其廢棄物處理按照傳染病廢棄物處理原則進行集中消毒處理。

樣本資源庫中的樣本質量對后續(xù)科學研究具有重要意義[12-13]。關于樣本的處理有報道在不同處理時間、不同處理溫度等條件下對血漿收集的影響，結果表明代謝產(chǎn)物與時間相關，隨著時間延長代謝產(chǎn)物會增多[14]。在PBMC分離技術方法方面，有報道為利用PBMC從而進行下游應用研究，可以根據(jù)研究目的選擇最佳的PBMC分離方法[15]。本研究主要對佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫中不同疾病人群的PBMC分離效果進行了比較。在檢測方法上，本研究通過AO/PI染料對細胞進行雙熒光染色，利用自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，避免人為主觀因素影響，并可以實現(xiàn)對樣本快速大量的計數(shù)。以往常用細胞活性檢測方法如臺盼蘭染色，耗時耗力，且較難達到精確計數(shù)。

從送入佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫中的標本中隨機選擇肝病患者、HIV感染者以及正常對照組，排除手術期患者、輸液患者、溶血凝血等影響分離PBMC的患者，標本均為當天新鮮采集，室溫放置。 分離PBMC都需要新鮮血液,最好不要超過24 h,佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫要求標本采集后6 h內(nèi)進行PBMC分離。首先測量采集的外周血血量，再利用密度梯度法分離PBMC，計算每毫升外周血分離出的細胞濃度。結果顯示(表1)3組人群PBMC細胞分離效果方面，對照組分離后不論是活細胞濃度還是總細胞濃度均為最高，其次為HIV感染者，最后為肝病患者。而細胞活性方面，對照組細胞活性高于肝病患者和HIV感染者。在全部為男性的分組中，也發(fā)現(xiàn)同樣的趨勢，即對照組在活細胞濃度和總細胞濃度方面最高，其次為HIV感染者，最后為肝病患者。而細胞活性也是對照組高于肝病患者和HIV感染者。在全部為女性的分組中，對照組分離后活細胞濃度和總細胞濃度均高于肝病患者，細胞活性雖然也高于肝病患者，但差異比較無統(tǒng)計學意義。

雖然PBMC細胞來源者存在個體差異，但是盡量選擇年齡性別一致的3組進行比較。結果提示患有肝病和HIV感染的患者在分離PBMC方面均受影響，HIV感染者因HIV病毒感染的靶細胞為T淋巴細胞[16]，分離效果受影響可從該方面解釋。肝病患者PBMC分離效果也受影響，有可能與肝病患者細胞免疫功能低下、體液免疫功能和細胞因子紊亂與亢進，免疫不平衡等所導致。國內(nèi)研究顯示乙肝患者外周血細胞數(shù)量降低，存在淋巴細胞亞群失衡和細胞免疫功能紊亂[17-18]。雖然不同疾病的患者PBMC細胞數(shù)量和活力有差異，在細胞凍存時，佑安醫(yī)院傳染病樣本資源庫根據(jù)細胞計數(shù)結果來凍存細胞，每凍存管中需要達到5×106細胞方可進行凍存。總之，研究結果為不同人群分離PBMC細胞研究提供了科學依據(jù)，對肝病患者和HIV感染者分離PBMC時應考慮其自身的疾病影響。