柑橘品種鑒定的SSR標記開發和指紋圖譜庫構建

李益，馬先鋒，唐浩，李娜，江東，龍桂友，李大志，牛英，韓瑞璽，鄧子牛

?

柑橘品種鑒定的SSR標記開發和指紋圖譜庫構建

李益1，馬先鋒1，唐浩2，李娜1，江東3，龍桂友1，李大志1，牛英4，韓瑞璽2，鄧子牛1

（1湖南農業大學園藝園林學院，長沙 410128；2農業部科技發展中心，北京 100122；3中國農業科學院柑桔研究所，重慶 400712；4廣西特色作物研究院，廣西桂林 541004）

【目的】篩選出一套SSR核心引物，用于構建柑橘品種的DNA指紋圖譜庫，為柑橘種苗認證、品種登記和植物新品種保護提供技術支撐。【方法】以柑橘屬8個主要栽培種類為試材進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出多態性豐富、擴增條帶穩定的引物對部分參試品種進行PCR擴增，擴增產物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行進一步的引物篩選；篩選得到的引物進行熒光標記，并選用部分柑橘品種進行PCR擴增，擴增產物利用基因分析儀檢測，分別計算各引物的值、等位基因數目，選取一套多態性豐富的適合進行熒光毛細管電泳檢測的SSR引物組合，進而對所有參試品種進行分析，構建柑橘品種的DNA指紋圖譜庫，同時利用篩選的SSR標記對參試品種進行鑒定。【結果】初期以柑橘屬8個種的代表品種（太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大紅甜橙、鄧肯葡萄柚、枸櫞、費米耐勞檸檬和墨西哥來檬）為材料，用362對SSR引物進行PCR擴增，擴增產物經4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步篩選出80對種間多態性高、擴增穩定的SSR引物；進一步從8個種類里選擇不同類型的64個柑橘品種，用上述篩選出的80對SSR引物進行PCR擴增，擴增產物經6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，再篩選出60對品種類型間多態性高、擴增穩定、條帶清晰的SSR引物，并分別進行熒光標記；另以168份柑橘品種為材料對上述60對SSR引物進行PCR擴增，經熒光毛細管電泳檢測，依據各引物的值、等位基因數目、峰圖讀取難易程度、擴增穩定性及染色體位置等，最終篩選出21對SSR引物作為指紋圖譜庫構建的核心引物。為消除不同儀器、不同試驗批次等引起的誤差，為21對SSR引物各主要等位變異選擇相應的參照品種。根據各引物標記的熒光顏色及擴增片段大小進行合理組合，21對SSR引物可分成5組進行多重電泳，共采集500份柑橘品種的DNA指紋。利用SSR標記，有111份品種僅用1對引物即可鑒別，86份品種用2對引物組合即可鑒別，24份品種用3對引物組合即可鑒別，另外279份品種雖無法單獨一一鑒別，但可分為87個小組，組內品種無法區分，組間品種易鑒別。【結論】利用篩選出的21對SSR核心引物，構建了包含500份柑橘品種的DNA指紋圖譜庫，篩選出部分品種的特異標記，可以鑒別221份柑橘品種和87個品種組合，構建了基于毛細管電泳平臺的柑橘SSR分子標記品種鑒定體系。

柑橘；SSR；毛細管電泳；品種鑒定；DNA指紋圖譜庫

0 引言

【研究意義】柑橘是多年生木本植物，可跨種屬雜交，種屬間雜種多，遺傳背景復雜。柑橘的主栽品種多起源于芽變，如甜橙、溫州蜜柑等，品種間遺傳背景高度一致，增加了品種鑒定工作的難度。中國作為柑橘的原生國之一，柑橘種質資源豐富，近年通過引種和育種，中國柑橘品種的類型及結構更加多樣化，國內各柑橘產區也培育了不少優良品種[1]。《中華人民共和國種子法》最新修改版規定品種需進行DUS（Distinctness, Uniformity, Stability）測試才能登記、審定及保護，因此，柑橘品種的鑒定工作不斷推進。盡管柑橘可根據枝葉形態等鑒別其屬種，但柑橘的形態學標記較少，種內品種間的差異不明顯。隨著分子生物學的發展，DNA分子標記鑒定因快速準確、不受環境影響等優點逐漸發揮重要作用，滿足品種快速準確鑒定和標準指紋圖譜構建的要求[2]。【前人研究進展】DNA分子標記技術廣泛應用于植物的遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建和種質鑒定等，其中SSR標記和SNP標記均為共顯性遺傳，染色體定位清楚且具有高通量自動化的潛力，因此，國際新品種保護聯盟（UPOV）的生物化學和分子生物學技術工作組（BMT）將其作為構建DNA指紋數據庫的首選標記；而SSR標記在單個位點上的多態性高于SNP標記，技術研究更加成熟，且SNP的儀器設備成本高，不利于推廣應用，因此，SSR標記因其各種優勢在品種鑒定和數據庫構建領域發揮越來越重要的作用[3]。近年來，主要農作物的DNA指紋檢測技術已經成熟，基于SSR分子標記的玉米、水稻、大豆、小麥等主要農作物的指紋圖譜庫已構建完成[3-10]。SSR分子標記已廣泛應用于柑橘的研究[11-12]，韓國輝[13]建立了基于EST-SSR、Genomic-SSR、SCoT的柑橘連鎖圖譜及雜種和多倍體遺傳分析；郭雁君等[14]利用SSR標記評價了廣東省肇慶地區地方柑橘品種與其他部分柑橘屬和近緣屬植物的親緣關系，為其分類和育種提供理論依據；曾濤[15]利用SSR分子標記構建了南豐蜜桔的指紋圖譜并分析了各南豐蜜桔的遺傳多樣性；雷天剛等[16]以聚丙烯酰胺凝膠電泳為平臺，用12對SSR引物和2個ISSR引物構建柑橘栽培品種（系）的DNA指紋圖譜庫，并賦予70個柑橘品種特征指紋代碼。【本研究切入點】目前，國內柑橘品種DNA指紋庫的構建大多基于瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，但是瓊脂糖凝膠電泳分辨率低，聚丙烯酰胺凝膠電泳制膠難度較大、步驟多且操作繁瑣，都不適合大量樣品的指紋采集。隨著優良品種的不斷選育、品種權保護的推廣及育種家對品種保護意識的提高等，這兩個平臺已無法滿足大量品種的DNA指紋鑒定。柑橘的指紋圖譜雖有報道，但不夠完善。【擬解決的關鍵問題】本研究從一系列基因組SSR和EST-SSR引物中篩選出一套多態性高、PCR擴增穩定、熒光峰型易識別的SSR引物組合，建立更加豐富的柑橘品種指紋圖譜庫，為柑橘種苗認證和DUS測試過程中近似品種的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于引物篩選和DNA指紋圖譜庫構建的種質共503份，其中456份來自中國農業科學院柑桔研究所國家資源圃，47份來自國家柑橘改良中心長沙分中心，包括9份大翼橙亞屬種質、16份枳、10份金柑、9份屬間雜種、20份枸櫞種質、162份寬皮柑橘、2份來檬、51份檸檬、12份葡萄柚、12份酸橙、19份甜橙、8份香橙、121份柚、52份柑橘屬內雜種。

1.2 DNA提取

每份種質取5片同齡幼嫩葉片等量混合，液氮研磨，采用改良的CTAB法[17]提取基因組總DNA。

1.3 SSR引物的選擇

依據參考文獻[17-25]報道的序列共合成362對SSR引物。在經瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選后的SSR引物上游5’端隨機標記6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4種熒光染料。普通引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，熒光引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.4 PCR擴增

PCR反應體系為dNTP 0.20 mmol·L-1、上下游引物各0.25 μmol·L-1、DNA聚合酶0.05 U·μL-1、1×buffer（含Mg2+2.5 mmol·L-1）和樣品DNA 2.5 ng·μL-1。PCR程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃—60℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環；72℃ 10 min。

PCR擴增產物經4%瓊脂糖凝膠電泳40—50 min（恒壓120 V），凝膠成像系統下拍照記錄。變性后的PCR擴增產物經6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離1—1.5 h（80 W恒定功率），銀染檢測[26]。將6-FAM、HEX熒光標記的PCR產物稀釋30倍，TAMRA和ROX熒光標記的PCR產物稀釋15倍，取等量稀釋后的產物混合并變性，上樣至3130XL基因分析儀進行片段分析，使用SSR指紋分析器讀取數據[7]。

1.5 引物多態性評價

利用（Polymorphism Information Content）評價引物多態性，計算公式：PIC＝1-∑P2，其中P表示標記的第個等位基因在群體中的頻率[27]。

2 結果

2.1 引物篩選和標記開發

2.1.1 引物初選 以柑橘屬8個種的代表品種（太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大紅甜橙、鄧肯葡萄柚、枸櫞、費米耐勞檸檬、墨西哥來檬）為材料，對362對SSR引物進行PCR擴增及4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中340對SSR引物擴增出目的片段，評價每對引物的多態性、擴增穩定性，初步篩選出80對種間多態性高、擴增穩定的SSR引物。

2.1.2 引物復選 從柑橘屬8個種中選擇不同類型的64份品種作為材料，對上述80對SSR引物進行PCR擴增及6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，評價每對引物的多態性、擴增穩定性和條帶清晰度等，篩選出60對多態性高、擴增穩定、帶型較清晰的SSR引物（圖1）。

2.1.3 引物精選 對上述篩出的60對SSR引物標記熒光染料，從柑橘屬8個種中的選擇不同類型的168份柑橘品種為材料進行PCR擴增，擴增產物經毛細管電泳檢測，根據各引物的值、等位基因數目、峰圖讀取的難易程度及染色體位置等，最終篩選出21對多態性高、擴增穩定、毛細管電泳峰型易讀取且在染色體上分布均勻的SSR引物作為指紋圖譜庫構建的核心引物[28]。21個位點的多態信息量（）變幅為0.550—0.871，平均為0.733（圖2、表1和表2）。

2.1.4 標記的校正統一與參照品種的選擇 統計各柑橘（品）種在21個SSR位點上的擴增片段大小并取整，用取整后的片段大小命名各等位變異。為消除不同儀器型號、不同試驗批次等造成的系統誤差并保證不同電泳平臺數據的一致性，為每對SSR引物的各等位變異選擇相應的參照品種（代表核心位點主要等位變異的一組樣品，輔助確定待測樣品在某個位點上的等位變異大小）（表2）。

2.2 柑橘（品）種DNA指紋圖譜庫的構建

根據引物標記的熒光顏色及等位變異的大小范圍進行組合，21對SSR引物可分成5組（表3），每組3—6對引物，同一組引物的PCR擴增產物混合后進行多重電泳，可提高試驗效率、降低成本。提取各柑橘樣品的DNA并進行PCR擴增，擴增產物依據引物分組進行毛細管多重電泳，采集各柑橘種質在21個SSR位點上的指紋數據，建立了包含500份柑橘種質的DNA指紋圖譜庫。在21個位點中共檢測到253個等位變異，每個位點的等位變異數為4—19個，平均約12個（表3）。

M：25 bp DNA Step ladder，1：福橘；2：興義大紅袍；3：南橘；4：黃果柑；5：早熟；6：陽山橘；7：本地早；8：甌柑；9：早熟克里曼丁；10：貢柑；11：永春椪柑；12：黃巖椪柑；13：太田椪柑；14：日南1號；15：大分4號；16：伊予柑；17：溫嶺高橙；18：秋輝；19：諾瓦；20：清見；21：維諾拉；22：世界蜜柚；23：默科特；24：凱旋柑；25：早香；26：陽香；27：桂平朱砂橘；28：滿頭紅；29：印度酸橘；30：枸頭橙；31：代代；32：朱欒；33：無核雪柑；34：莫洛；35：大紅甜橙；36：夏沙蜜柚；37：北碚柚；38：金蘭柚；39：五布紅心柚；40：強德勒柚；41：勐倫早柚；42：橘湘紅；43：沙田柚；44：馬家柚；45：玉環柚；46：四季拋；47：曼賽龍柚；48：奧羅布蘭克；49：鄧肯葡萄柚；50：馬敘葡萄柚；51：雞尾葡萄柚；52：木里香櫞；53：小香櫞；54：長果香櫞；55：美國枸櫞；56：枸櫞；57：野生香櫞；58：大香櫞；59：墨西哥來檬；60：印特多納多；61：尤力克檸檬；62：橙花；63：白黎檬；64：北京檸檬

圖2 引物P8在4個柑橘品種中檢測到的等位變異

2.3 特異標記的篩選和種質鑒定

篩選了部分柑橘屬種的特異標記（屬、種內品種間條帶一致，同時區別于其他屬、種的品種），為跨屬種雜交后代的鑒定及柑橘品種的屬種鑒別提供參考（表4）。

分析500份柑橘種質在21個位點上的指紋數據，221份柑橘種質可準確鑒別：獨立標記可鑒別111份種質，2對引物組合可鑒別86份種質，3對引物組合可鑒別24份種質，大翼橙亞屬、枸櫞、雜柑、柚類等易鑒別；279份種質暫時無法鑒別，但可分成87組，每組包含2—17份種質，同組的種質暫時無法區分，但組間種質易鑒別；不能鑒別的種質主要為芽變品種或同物異名，如溫州蜜柑、椪柑、葡萄柚、檸檬、甜橙等種質難以鑒別。

3 討論

良種是現代農業發展的基礎，優良品種的選育工作受到越來越多的重視，本研究的植物材料“柑橘”為木本果樹，開花結果需要經歷“童期”這一特殊植物生理階段，因此果樹新品種的選育需投入大量的時間、精力和財力，如果選育的新品種不能得到有效保護，會打擊育種者的積極性，不利于品種的持續創新[29]。植物新品種保護是國家知識產權戰略的重要組成部分，中國越來越重視植物品種權的保護，育種者的保護意識不斷提高，柑橘新品種保護的申請量和DUS測試量逐年增加；但是由于柑橘具有：（1）不同屬、種或品種間可相互授粉雜交，雜種類型繁多；（2）柑橘栽培品種主要通過嫁接等無性繁殖方式繁育，易通過自我繁殖竊取新品種權益；（3）同一品種在不同種植區域往往存在不同名稱的現象，導致柑橘品種的監管難度大。近年來，柑橘產業受黃龍病、潰瘍病等病害的影響，產量和質量都大大降低，優良苗木需求旺盛[30-31]，各柑橘主產省份已建成或正在新建無病毒苗圃，且部分研究機構已開展柑橘的種苗認證工作，明確柑橘苗木的真實身份。UPOV將DUS測試作為新品種登記和保護的基本條件[32]，本研究篩選的柑橘SSR引物及建立的DNA指紋圖譜庫可用于柑橘新品種DUS測試中近似品種的篩選以及種苗市場監管的身份快速鑒定，有利于柑橘育種和品種資源保護。

表1 引物編號及序列

表2 用于柑橘屬（品）種DNA指紋鑒定的21個標記

續表2 Continued table 2

參照品種是代表核心位點主要等位變異的一組樣品。輔助確定待測樣品在某個位點上等位變異的大小，校正儀器設備的系統誤差

The reference variety is a set of samples representing the main alleles of the core site. Being used to assist in determining the size of an extended segment of the size of alleles at a certain site, correcting of system error of instrument and equipment

表3 21個熒光標記引物的分組

括號內為等位變異的大小范圍 The number in the brackets indicate the range of allele sizes

表4 柑橘屬種的特異標記

252/265代表引物在樣品中擴增出2條片段，一條為252 bp，一條為265 bp。“/”表示暫未找到該屬種的特異標記

252/265 represent that primer is amplified in two fragments in the sample, with a size of 252 bp and a size of 265 bp. “/” means that this specific molecular of genus-species currently have not be found

目前，柑橘品種鑒定和指紋圖譜庫構建取得了較好的進展。吳鑫[33]篩選出34對SSR引物和3個ISSR引物對126份柑橘材料進行鑒定，SSR標記可鑒定66份品種，ISSR標記可鑒定27份品種；雷天剛等[16]篩選出12對SSR引物和2個ISSR引物對102份柑橘材料進行鑒定，SSR標記可鑒定42份品種，ISSR標記可鑒定28份品種。本研究用21對SSR引物鑒定500份柑橘種質，其中221份材料可準確鑒別，SSR標記在寬皮柑橘、雜柑、柚類等品種間多態性高，與前人的結果一致；將暫時區分不開的材料歸為一類，剩余的279份材料分為87類，不同類的品種易鑒別。由于SSR標記在甜橙、溫州蜜柑、紅橘等芽變品種中的多態性較低，前人利用ISSR標記能夠鑒別部分芽變品種，考慮到ISSR標記重復性差、非特異性片段多、數據間難以整合，不適于毛細管電泳平臺，因此，本研究未選用ISSR標記。本研究選用的品種覆蓋了柑橘屬各主栽品種、枸櫞、酸橙及枳屬和金柑屬的部分（品）種，具有較好的代表性。篩選的21對SSR引物在染色體上分布較均勻、多態性高，通過特異標記及其組合可以有效鑒別目前大多數廣泛栽培的品種。另外，本研究利用毛細管電泳平臺構建DNA指紋圖譜庫，克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳操作繁瑣、費時費力、自動化程度低的缺點，能夠高通量地采集數據，提高品種鑒定的效率[34]。柑橘是多年生木本植物，具有童期長、遺傳背景復雜、部分栽培品種為芽變品種等特點，而芽變屬體細胞變異，與芽變母本的遺傳背景一致，SSR引物難以覆蓋到變異位點，因此，SSR標記用于柑橘品種的鑒定存在一定的局限性[35]。隨著基因組測序技術的發展，可結合SNP或簡化基因組測序用于進一步鑒定芽變品種[36-38]。

4 結論

篩選出21對SSR核心引物，建立了基于毛細管電泳平臺的柑橘品種SSR分子標記鑒定體系，構建了包含500份柑橘種質的DNA指紋圖譜庫，可用于柑橘品種的鑒別。

[1] 沈兆敏. 我國柑橘產銷現狀、發展趨勢及對策建議. 果農之友. 2012(03): 3-4.

SHEN Z M. Citrus’ production, trend of development and countermeasures in China., 2012(03): 3-4. (in Chinese)

[2] 朱巖芳. 作物品種分子標記鑒定及指紋圖譜構建研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2013.

ZHU Y F. Research on cultivar identification and DNA fingerprinting of crops based on molecular markers[D].Hangzhou: Zhejiang University, 2013. (in Chinese)

[3] 王鳳格, 楊揚, 易紅梅, 趙久然, 任潔, 王璐, 葛建镕, 江彬, 張憲晨, 田紅麗, 侯振華. 中國玉米審定品種標準SSR指紋庫的構建. 中國農業科學, 2017, 50(1): 1-14.

WANG F G, YANG Y, YI H M, ZHAO J R, REN J, WANG L, GE J R, JIANG B, ZHANG X C, TIAN H L, HOU Z H. Construction of an SSR-based standard fingerprint database for corn variety authorized in China., 2017, 50(1): 1-14. (in Chinese)

[4] 劉文彬. 適于玉米品種鑒定的高通量SSR標記開發及復合體系建立[D]. 長春: 吉林農業大學, 2017.

LIU W B. Development high throughput SSR markers about suitable maize cultivar identification and buildig compound system[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2017. (in Chinese)

[5] 鄧姍, 褚云霞, 黃志城, 楊華, 顧可飛, 陳海榮. 上海地區水稻已知品種SSR指紋圖譜庫構建. 中國農學通報, 2015, 31(3): 7-15.

DENG S, CHU Y X, HUANG Z C, YANG H, GU K F, CHEN H R. Establishment of DNA fingerprint database of rice varieties in Shanghai., 2015, 31(3): 7-15. (in Chinese)

[6] 徐海風, 程保山, 楊加銀, 沈業松. 黃淮海地區夏大豆品種(系)指紋圖譜的構建及其遺傳多樣性分析. 西南農業報, 2014, 27(5): 1814-1819.

XU H F, CHENG B S, YANG J Y, SHEN Y S. Establishment of SSR fingerprint map and analysis of genetic diversity among soybean variety in Huang-Huai-Hai region., 2014, 27(5): 1814-1819. (in Chinese)

[7] 鄭永勝, 張晗, 王東建, 孫加梅, 王雪梅, 段麗麗, 李華, 王瑋, 李汝玉. 基于熒光檢測技術的小麥品種SSR鑒定體系的建立. 中國農業科學, 2014, 47(19): 3725-3735.

ZHENG Y S, ZHANG H, WANG D J, SUN J M, WANG X M, DUAN L L, LI H, WANG W, LI R Y. Development of a wheat variety identification system based on fluorescently labeled SSR markers., 2014, 47(19): 3725-3735. (in Chinese)

[8] 宋偉林. 基于SSR熒光標記毛細管電泳的油菜品種DNA指紋鑒定技術平臺的建立與應用[D]. 北京: 中國農業科學院, 2013.

SONG W L. Establishment and application of a technology platform for DNA fingerprint identification of rapeseed cultivars based on capillary electrophoresis with SSR fluorescence markers[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences,2013. (in Chinese)

[9] 王瑞, 張福耀, 程慶軍, 田承華, 凌亮. 利用SSR熒光標記構建20個高粱品種指紋圖譜. 作物學報, 2015, 41(4): 658-665.

WANG R, ZHANG F Y, CHENG Q J, TIAN C H, LING L. Establishment of 20 sorghum hybrids fingerprints using SSR fluorescent marker., 2015, 41(4): 658-665. (in Chinese)

[10] 張晗, 王東建, 孫加梅, 鄭永勝, 姚鳳霞, 許金芳, 宋國安, 段麗麗, 李華, 王雪梅, 李汝玉. 大白菜高通量SSR標記鑒定體系的建立和應用. 植物遺傳資源學報, 2014, 15(4): 815-823.

ZHANG H, WANG D J, SUN J M, ZHEN Y S, YAO F X, XU J F, SONG G A, DUAN L L, LI H, WANG X M, LI R Y. Development and application of a high-throughput chinese cabbage dna profiling system based on SSR markers., 2014, 15(4): 815-823. (in Chinese)

[11] 梁武軍, 解凱東, 郭大勇, 謝宗周, 徐強, 伊華林, 郭文武. 柑橘10個品種實生后代多倍體的發掘及SSR鑒定. 園藝學報, 2014, 41(3): 409-416.

LIANG W J, XIE K D, GUO D Y, XIE Z Z, XU Q, YI H L, GUO W W. Spontaneous generation and SSR characterization of polyploids from ten citrus cultivars., 2014, 41(3): 409-416.(in Chinese)

[12] 劉通, 鄧崇嶺, 程玉芳, 李秋景, 陳傳武，劉冰浩, 伊華林. 利用SSR和SRAP技術分析廣西柑橘種質遺傳多樣性. 華中農業大學學報, 2016, 35(2):23-29.

LIU T, DENG C L, CHENG Y F, LI Q J, CHEN C W, LIU B H, YI H L. Analysis of genetic diversity of citrus in Guangxi by SSR and SRAP., 2016, 35(2): 23-29.(in Chinese)

[13] 韓國輝. 基于EST-SSR、Genomic-SSR和SCoT標記的柑橘連鎖圖譜構建及雜種和多倍體遺傳分析[D]. 重慶: 西南大學, 2012.

HAN G H. Construction of molecular linkage map and genetic analysis of hybrids and polyploidy of citrus based on EST-SSR, genomic-SSR and Scot markers[D]. Chongqing: Southwest University, 2012(in Chinese)

[14] 郭雁君, 曾繼武, 胡亞平,郭麗英, 蔣惠, 周希琴, 吉前華. 基于SSR標記的肇慶地區柑橘品種分類地位研究. 中國農學通報, 2014, 30(4):137-143.

GUO Y J, ZENG J W, HU Y P, GUO L Y, JIANG H, ZHOU X Q, JI Q H. Classification of Zhaoqing local citrus germplasm resources based on simple sequence repeat molecular marker analysis., 2014, 30(4):137-143. (in Chinese)

[15] 曾濤. 南豐蜜橘SSR指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析[D]. 南昌: 江西農業大學, 2012.

ZENG T. Construction of fingerprinting and analysis of genetic diversity with SSR markers for Nangfeng tangerine[D]. Nanchang: Jiangxi Agricultural University, 2012. (in Chinese)

[16] 雷天剛, 何永睿, 吳鑫, 姚利曉, 彭愛紅, 許蘭珍, 劉小豐, 陳善春. 柑橘栽培品種(系)DNA指紋圖譜庫的構建. 中國農業科學, 2009, 42(8): 2852-2861.

LEI T G, HE Y R, WU X, YAO L X, PENG A H, XU L Z, LIU X F, CHEN S C. Construction of DNA fingerprinting database of citrus cultivars(line)., 2009, 42(8): 2852-2861. (in Chinese)

[17] 張文. 抗潰瘍病枸櫞C05雜交后代的獲得及分子標記鑒定[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2013.

ZHANG W. The hybrids obtainment of citron C05 resistant to canker disease and the identification by molecular[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[18] Kijas J M, Thomas M R. An evaluation of sequence tagged microsatellite site markers for genetic analysis within citrus and related species., 1995, 38: 349-355.

[19] 魯玉洋. 利用SSR和RAPD技術構建柑桔分子遺傳圖譜[D]. 重慶: 西南大學, 2006.

LU Y Y. Construction of genetic linkage maps of citrus based on SSR and RAPD marker master candidate[D]. Chongqing: Southwest University, 2006. (in Chinese)

[20] 江東, 鐘廣炎, 洪棋斌. 柑橘EST-SSR分子標記分析. 遺傳學報, 2006, 33(4): 345-353.

JIANG D, ZHONG G Y, HONG Q B. Analysis of microsatellites in citrus unigenes., 2006, 33(4): 345-353. (in Chinese)

[21] 曾柏全. 寬皮柑橘資源遺傳多樣性的分子評價[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2009.

ZENG B Q. Genetic diversity of mandarin investigated by molecular markers[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2009. (in Chinese)

[22] 范達. 基于DNA指紋圖譜的柑橘種苗純度與真實性檢測技術研究[D]. 重慶: 西南大學, 2011.

FAN D. DNA fingerprinting inspection technique for citrus nursery tree purity and genuineness[D]. Chongqing: Southwest University, 2011. (in Chinese)

[23] 譚洪泉. 柑橘雜種胚組織培養挽救及分子標記早期鑒定技術研究[D]. 重慶: 西南大學, 2011.

TAN H Q. Early rescue and identification of citrus hybrid embryo in vitro via SSR technology[D]. Chongqing: Southwest University, 2011. (in Chinese)

[24] 韓會君. 紅橘優系遺傳鑒定及起源研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2013.

HAN H J. The genetic identification and origin study of red tangerine elite accession[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[25] 龍蕩. 基于轉錄組測序大規模開發早實枳SSR標記[D]. 武漢: 華中農業大學, 2014.

LONG D. Large-scale development of SSR markers based on transcriptome sequence of precocious trifoliate orange[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2014. (in Chinese)

[26] 鮑思元. DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗教學改進. 實驗科學與技術, 2015, 13(2): 122-124.

BAO S Y. Improvement of DNA denaturing polyacrylamide gel electrophoresis in experiment teaching., 2015, 13(2): 122-124. (in Chinese)

[27] Anderson J A, Churchill G A, Autrique J E, Tanksley S D, Scorells M E. Optimizing parental selection for genetic linkage maps., 1993, 36(1): 181-186.

[28] NY/T 2594-2016, 植物品種鑒定DNA分子標記法總則.

NY/T 2594-2016, General guideline for identification of plant varieties using DNA markers. (in Chinese)

[29] 胡凱. UPOV公約下我國植物新品種保護制度分析. 中國科技論壇, 2013(9): 91-96+145.

HU K. The system of new plant varieties of china under the framework of UPOV convention., 2013 (9):91-96+145. (in Chinese)

[30] 張雪英. 淺談柑橘無病毒苗木繁育技術. 農業與技術, 2015, 35(3): 104-105.

ZHANG X Y. A brief discussion on citrus seedless seedling breeding technology., 2015, 35(3): 104-105. (in Chinese)

[31] 張建梅, 劉永忠, 李鳳英, 張欣, 鄭吉祥. 桂林市柑橘無病毒苗木生產現狀調查及發展建議. 南方園藝,2014,25(5):36-38+40.

ZHANG J M, LIU Y Z, LI F Y, ZHANG X, ZHENG J X. Investigation and development Suggestions on the production of citrus seedless seedlings in Guilin., 2014, 25(5): 36-38+40. (in Chinese)

[32] Pimenta S, Rodrigues R, Sudré C P, Moraes J G T, Bento C S, Medeiros A M. Protecting vegetable cultivars in Brazil: a chili pepper case-study research., 2016, 34(2): 161-167.

[33] 吳鑫. 柑桔DNA指紋圖譜庫的構建與分析[D]. 重慶: 西南大學, 2008.

WU X. Construction and analysis of DNA fingerprinting database for citrus cultivars[D]. Chongqing: Southwest University, 2008. (in Chinese)

[34] 任小平, 鄭艷麗, 黃莉, 陳玉寧, 周小靜, 陳偉剛, 雷永, 晏立英, 萬麗云, 廖伯壽, 姜慧芳. 花生SSR核心引物篩選及育成品種DNA指紋圖譜構建. 中國油料作物學報, 2016, 38(5): 563-571.

REN X P, ZHENG Y L, HUANG L, CHEN Y N, ZHOU X J, CHEN W G, LEI Y, YAN L Y, WAN L Y, LIAO B S, JIANG H F. Selection of core SSR markers and identification of fingerprint on peanut cultivars., 2016, 38(5): 563-571. (in Chinese)

[35] 李小孟, 雷天剛, 陳偉, 吳安輝, 黎秋剛, 周天平, 王燕, 孫世秀, 陳善春, 何永睿. 沙田柚芽變品種“真龍柚”的分子標記鑒定. 中國南方果樹, 2016, 45(5): 52-54.

LI X M, LEI T G, CHEN W, WU A H, LI Q G, ZHOU T P, WANG Y, SUN S X, CHEN S C, HE Y R. Identification of Shatinyu mutant cultivar “zhenlong pumelo” molecular markers., 2016, 45(5): 52-54. (in Chinese)

[36] Sun X W, Liu D Y, Zhang X X F, Li W B, Liu H, Hong W G, Jiang C B, Guan N, Ma C X, Zeng H P, Xu C H, Song J, Huang L, Wang C M, Shi J J, Wang R, Zheng X H, Lu C Y, Wang X W, Zheng H K. SLAF-seq: An efficient method of large-scale de novo SNP Discovery and genotyping using high- throughput sequencing., 2013, 8(3): e58700.

[37] Ma J Q, Huang L, Ma C L, JIN J Q, LI C F, WANG R K, ZHENG H K, YAO M Z, CHEN L.Large-scale SNP discovery and genotyping for constructing a high-density genetic map of tea plant using specific-locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq)., 2015, 10(6): e0128798.

[38] ZHANG Y X, WANG L H, XIN H G, LI D H, MA C X, DING X, HONG W G, ZHANG X R. Construction of a high-density genetic map for sesame based on large scale marker development by specific length amplified fragment (SLAF) sequencing., 2013, 13(1): 141.

（責任編輯 李莉）

SSR markers screening for identification of citruscultivar and construction of DNA fingerprinting library

LI Yi1, MA XianFeng1, TANG Hao2, LI Na1, JIANG Dong3, LONG GuiYou1, LI DaZhi1, NIU Ying4, HAN RuiXi2, DENG ZiNiu1

(1College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;2Development Center for Science and Technology, Ministry of Agriculture, Beijing 100122;3Institute of Citrus Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712;4Guangxi Academy of Specialty Crops, Guilin 541004, Guangxi)

【Objective】The purpose of the present work aims at the construction of DNA fingerprint library of citrus cultivar by using a series of SSR core primers in order to provide references for citrus nursery plant identification, cultivars registration and plant variety protection. 【Method】SSR primers were primarily screened by analyzing 8 mainly cultivated species belonging towhile the PCR products were separated by agarose gel electrophoresisthe primers that generated high polymorphic and stable PCR products were chosen for further PCR amplification with more citrus cultivars, and the PCR products were separated by polyacrylamide gel electrophoresis. the further screened primers were labeled with fluorescent and used for amplification of the all tested cultivars. The PCR products were detected by fluorescence capillary electrophoresis and the primers suitable for fluorescent capillary electrophoresis were screened according to their, number of alleles identified, and employed to construct the citrus cultivar DNA fingerprinting library, and the selected primers were used to identify the tested cultivars.【Result】Firstly, 80 pairs of polymorphic and stable primers were chosen from 362 SSR primers by 4% agarose gel electrophoresis with representative cultivars of 8 species ofgenus(including Ota ponkan, Shatian pummelo, Yuanjiang soar orange, Dahong sweet orange, Duncan grapefruit, citron, Femminello lemon, Mexico lime); Secondly, 60 pairs of SSR primers with high polymorphism, stability and clear amplification products were further selected from the above 80 pairs of primers by 6% polyacrylamide gel electrophoresis with 64 citrus cultivars and labeled with fluorescent dyes; Thirdly, 21 pairs of SSR core primers were verified for the construction of fingerprint library from above 60 pairs of primers by capillary electrophoresis with 168 citrus cultivars on the basis of, the allele number, peak reading difficulty, amplification stability and chromosome location. The corresponding reference cultivars were selected for 21 pairs of primers to eliminate the errors caused by different instruments and experimental batches. Through the multiple electrophoresis with the 5 combination groups of 21 primers according to the color and size of amplified fragment, we established 500 citrus cultivars fingerprinting library. Among the tested cultivars, 111 were identified by using only one pair of primers, 86 with the combination of two pairs of primers; and 24 with the combination of 3 pairs of primers, the remaining 279 cultivars were not able to be identified individually, they could, however, be divided into 87 groups, between which it was clearly distinguished but within which the cultivars were indistinguishable.【Conclusion】The DNA fingerprint library containing 500 citrus cultivars was constructed by using 21 pairs of screened SSR core primers, the specific markers for some cultivars were selected; 221 cultivars and 87 cultivar groups were identified; and a citrus cultivar identification system based on SSR fluorescence labeling was constructed.

; SSR; capillary electrophoresis; variety identification; DNA fingerprints

2018-01-19；

2018-03-28

國家自然科學基金（31720103915）、2018年農產品質量安全監管專項（111721301092361007）、廣西柑橘新品種選育及無病毒苗木繁殖研究特聘專家崗位

李益，E-mail：1946494060@qq.com。通信作者鄧子牛，E-mail：deng7009@163.com。通信作者韓瑞璽，E-mail：wudifeixue007@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.0012