初步探討石蠟標(biāo)本制備方案的選擇及ALK2在小鼠牙胚中的表達(dá)

張雪 趙歡 李媛 張琦 胡月 史冊(cè) 孫宏晨

牙作為人體最硬的組織，提供咀嚼、支持、發(fā)音、維持面部形態(tài)等功能。齲壞、酸蝕、外傷等可造成牙體缺損甚至缺失，影響咀嚼、消化、美觀，造成關(guān)節(jié)紊亂等[1]。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的提高和牙相關(guān)疾病研究的深入，小鼠動(dòng)物模型成為研究模擬人類牙發(fā)育相關(guān)疾病發(fā)生的不可缺少的一部分，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立基因敲除或基因過(guò)表達(dá)等動(dòng)物模型[2]，探討牙發(fā)育調(diào)控機(jī)理。小鼠牙胚標(biāo)本的制備是小鼠牙胚實(shí)驗(yàn)研究的前期重要步驟。組織的固定、脫水以及石蠟包埋等步驟的條件是影響切片質(zhì)量和染色質(zhì)量的關(guān)鍵。

牙發(fā)育始于牙胚上皮和間充質(zhì)相互作用，牙乳頭在成釉器內(nèi)釉上皮的刺激下，形成成牙本質(zhì)細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞再礦化形成牙本質(zhì)，而內(nèi)釉上皮在牙本質(zhì)的刺激下形成成釉細(xì)胞，成釉細(xì)胞分泌基質(zhì)形成釉質(zhì)[3]。多種信號(hào)通路參與牙發(fā)育，主要包括骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、WNT、SHH(sonic hedgehog)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)信號(hào)通路[4]等。研究發(fā)現(xiàn)，BMP信號(hào)通路異常導(dǎo)致牙胚發(fā)育停留在牙板期/蕾狀期[5]，而B(niǎo)MP信號(hào)增強(qiáng)又可促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成[6]。

BMP信號(hào)通路的激活需要受體的激活以及下游信號(hào)的傳導(dǎo)[7]。BMP受體包括Ⅰ型和Ⅱ型受體[8]。BMP和受體結(jié)合后，主要依賴Ⅰ型受體的GS偶聯(lián)區(qū)激活下游的SMAD1/5/8，從而發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)的作用[7]。Ⅰ型受體包括ALK3(activin receptor like kinase 3)、ALK6(activin receptor like kinase 6)和ALK2(activin receptor like kinase 2)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，ALK3基因敲除可導(dǎo)致牙發(fā)育遲緩[9]，ALK6敲除對(duì)牙發(fā)育無(wú)明顯影響，而關(guān)于ALK2在牙發(fā)育中的作用卻未見(jiàn)報(bào)道。為了初步探討ALK2在牙發(fā)育中的作用，我們利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)ALK2蛋白在牙發(fā)育中的表達(dá)分布。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

C57/BL6小鼠(吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，PBS(ZL1-9062, 中杉金橋)，多聚甲醛、乙醇、二甲苯、蘇木素及伊紅Y 染色液(北京化工有限公司)。ALK2抗體(Abcam，ab60157)，免疫組化試劑盒(No.9706，博邁德);DAB(ZL1-9019，中杉金橋);體視顯微鏡(SZX16)、電子顯微鏡(vanox，Olympus，日本)。

1.2 胚齡的確定及不同胎齡小鼠牙胚的制備

將2 月齡的雌鼠和雄鼠合籠，以發(fā)現(xiàn)陰栓為準(zhǔn)，記為E0.5。分別于E12.5、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5、E17.5和E18.5，脫頸處死孕鼠，暴露腹腔，可見(jiàn)串珠狀的胚胎位于子宮內(nèi)，取出子宮及胚胎，立即放在預(yù)冷并新鮮的4%多聚甲醛中，4 ℃固定過(guò)夜。流水沖洗后，按流程脫水(表 1)，浸蠟包埋。

1.3 牙胚石蠟切片及HE染色

將蠟塊常規(guī)切片(切片厚度3 μm)，經(jīng)二甲苯脫蠟至水，蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin，HE)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

取E18.5的胚胎，按上述方案石蠟包埋、切片，進(jìn)行免疫組化染色。具體步驟為：脫蠟至水，胰酶修復(fù)，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，兔抗鼠ALK2抗體4 ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3×5 min;滴加生物素標(biāo)記二抗, 37 ℃孵育10 min, PBS沖洗3×5 min; 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素生物素工作液，37 ℃孵育20 min, PBS沖洗3×5 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表 1 不同時(shí)期牙胚脫水過(guò)程及脫水時(shí)間

2 結(jié) 果

2.1 小鼠胚胎大體形態(tài)

通過(guò)體視顯微鏡觀察，E14.5的胚胎較小，后頸部突出，頭部和眼球輪廓已出現(xiàn)，四肢包繞在未成形的皮膚中，肝臟較大，呈鮮紅色。此時(shí)，皮膚發(fā)育基本完成，手掌、腳掌已獨(dú)立出來(lái)，具有小鼠的基本形態(tài)(圖 1)。

圖 1 小鼠胚胎大體觀

2.2 脫水時(shí)間調(diào)整前后牙胚切片比較

文獻(xiàn)中報(bào)道的脫水時(shí)間較長(zhǎng)[10]，為了提高實(shí)驗(yàn)效率，我們適當(dāng)縮短了脫水時(shí)間(表 1)。研究可以發(fā)現(xiàn)調(diào)整后E16.5的牙胚切片完整無(wú)裂痕，HE染色清晰，2 組牙胚形態(tài)無(wú)差異(N=5，P>0.05)。這說(shuō)明，調(diào)整后的牙胚脫水時(shí)間合理且規(guī)范(圖 2)。

圖 2 不同脫水時(shí)間的E16.5牙胚形態(tài) (HE，×10)

Fig 2 HE staining of different dehydration times for E16.5 dental germ (HE，×10)

2.3 小鼠胚胎期牙胚發(fā)育過(guò)程

HE染色顯示，小鼠牙發(fā)育始于E12.5，此時(shí)，上皮增厚；在E13.5，增厚的上皮向間充質(zhì)延伸，似花蕾狀，為蕾狀期[3]；在E14.5，上皮繼續(xù)向間充質(zhì)延伸，呈帽狀包繞部分間充質(zhì)，為帽狀期[3]；在E16.5，牙胚發(fā)育至鐘狀早期，成釉器分為四層，從內(nèi)向外依次為內(nèi)釉上皮、中間層、星網(wǎng)狀層、外釉上皮，其中，中間層的細(xì)胞核居中，形態(tài)不明顯[3]；在E18.5，牙胚發(fā)育至鐘狀晚期，中間層細(xì)胞間隙變大(圖 3)。

2.4 ALK2在牙胚中的時(shí)間和時(shí)空表達(dá)

免疫組化染色顯示，ALK2在陽(yáng)性對(duì)照組織(人肝癌組織)中廣泛表達(dá)，不僅表達(dá)于細(xì)胞膜，也表達(dá)于細(xì)胞漿。在牙胚中，我們發(fā)現(xiàn)， ALK2在牙胚蕾狀期、帽狀期的口腔上皮和間充質(zhì)中都有表達(dá)。鐘狀期時(shí)， ALK2不僅在成釉器中表達(dá)，也在牙乳頭中廣泛表達(dá)(圖 4)。

圖 3 牙胚HE染色

3 討 論

3.1 小鼠胚胎固定液的選擇，脫水和透明時(shí)間的確定

眾所周知，標(biāo)本固定不僅可盡量保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，也可凝固細(xì)胞自身蛋白，防止酶反應(yīng)，發(fā)生自溶現(xiàn)象，又最大量的保留mRNA和蛋白[11]。常用的固定液見(jiàn)表2，其中，4%多聚甲醛可保留完整蛋白質(zhì)，mRNA固定效果好，非特異性染色低，是較為理想的固定液(表 2)。

固定后的脫水是影響標(biāo)本質(zhì)量的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，若脫水不足，影響浸蠟；脫水過(guò)度，影響切片。組織脫水原則有：①充分脫水又不過(guò)脫；②梯度脫水；③組織依賴性，如，肝脾等組織，由于組織較脆，含血較多，一般脫水要快，防止脫水過(guò)度[12]；而腦組織由于含有大量的腦磷脂需要較長(zhǎng)的脫水時(shí)間，以防脫片[13]。因此，參考之前的文獻(xiàn)，我們結(jié)合牙胚的組織特異性，摸索并制定出符合牙胚脫水的方案。

實(shí)驗(yàn)顯示，該方案所選擇的固定液合適，所設(shè)計(jì)的脫水時(shí)間合理。與以往的脫水方案相比，本方案在保證切片和染色質(zhì)量的基礎(chǔ)上，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。本方案為牙胚發(fā)育生物學(xué)的高效研究提供了良好的技術(shù)支持和參考。

3.2 ALK2在牙胚中的作用

ALK2廣泛地表達(dá)于機(jī)體的不同組織，如骨、軟骨、心臟等[14]。研究表明， ALK2基因敲除后，小鼠出現(xiàn)下頜骨發(fā)育不全和心臟功能障礙[15]；而ALK2基因構(gòu)成性活化可導(dǎo)致進(jìn)行性纖維骨化癥(fibrodysplasia ossificans progressiva ,FOP)，表現(xiàn)為異位骨化[14]。這說(shuō)明，ALK2在不同組織器官中具有不同的生理功能，而ALK2在組織中的表達(dá)是研究其功能的基本和必要條件。因此，我們擬初步利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)ALK2在牙發(fā)育中的表達(dá)，從而探討ALK2在牙發(fā)育中的作用[16]。

表 2 各種常見(jiàn)固定液的信號(hào)強(qiáng)度、背景染色及RNA保留能力的比較

Tab 2 Comparison of signal intension, background staining and RNA reservation ability among usual fixatives

固定劑信號(hào)背景RNA保留多聚甲醛(4%)100100100中性福爾馬林4510046Zenker(秦克)100600110Boutin固定液6010077Carnoy(卡諾)4010033

免疫組化結(jié)果顯示：①ALK2在蕾狀期的口腔上皮中就有表達(dá)；②ALK2在帽狀期的口腔上皮和間充質(zhì)中均有表達(dá)；③ALK2在成釉器的內(nèi)釉上皮、中間層、星網(wǎng)狀層和外釉上皮中均有表達(dá)；④ALK2在牙乳頭中廣泛表達(dá)；⑤ALK2在牙發(fā)育中從蕾狀期至鐘狀晚期持續(xù)性表達(dá)。這提示我們：①ALK2在牙發(fā)育早期可能發(fā)揮作用，調(diào)控牙發(fā)育的起始；②ALK2可能調(diào)控上皮-間充質(zhì)相互作用，影響牙本質(zhì)和釉質(zhì)的形成；③ALK2可能在牙發(fā)育蕾狀期至鐘狀期持續(xù)性影響牙發(fā)育。

綜上，本研究表明，ALK2在牙發(fā)育早期就有表達(dá)，且持續(xù)表達(dá)于整個(gè)牙發(fā)育過(guò)程，我們推測(cè)了ALK2在牙發(fā)育中的可能性作用。然而，ALK2對(duì)牙本質(zhì)形成的作用以及間充質(zhì)中ALK2對(duì)內(nèi)釉上皮分化的影響等機(jī)理研究仍有待探討。