季銨鹽包裹溴化銀納米復(fù)合物改性樹脂基質(zhì)的抗菌及機械性能評價

陳銀燕 張瑜 柴治國 沈麗娟 邢曉東 肖玉鴻

復(fù)合樹脂以其美觀與功能兼優(yōu)的特點而被廣泛應(yīng)用于口腔臨床牙體缺損修復(fù)中[1]，但是，復(fù)合樹脂較其它修復(fù)材料表面更易粘附細菌[2]，且繼發(fā)齲發(fā)生率高，易導(dǎo)致修復(fù)失敗[3]。因此，研發(fā)抗菌性樹脂材料是減少繼發(fā)齲發(fā)生、預(yù)防修復(fù)失敗的重要途徑[4]。大量研究報道將銀納米顆粒或季銨鹽分別添加至樹脂中獲得抗菌性能[2,4]。單獨添加銀納米顆粒與樹脂基質(zhì)間無化學(xué)連接，僅簡單分散于樹脂基質(zhì)中，因此，釋出速率難以控制，抗菌活性隨時間而降低。同時，抗菌成分的釋出將影響載體材料的機械性能，且對周圍組織產(chǎn)生一系列副作用[5-6]。可聚合季銨鹽單體可與樹脂基質(zhì)成分發(fā)生聚合反應(yīng)，形成化學(xué)結(jié)合[7]，因此，具有不易釋出及化學(xué)性能穩(wěn)定的特點，適量添加至樹脂中對載體材料的機械性能無顯著影響[8]，但有限的添加量限制了其抗菌活性，而添加量過大會導(dǎo)致化學(xué)結(jié)合不穩(wěn)定、影響載體材料整體性能及穩(wěn)定性等一系列問題的產(chǎn)生[9]。因此，兩類材料在抗菌時效、抗菌效率及對載體材料的影響等方面各有優(yōu)缺點，如何研發(fā)兼具兩者優(yōu)勢的復(fù)合抗菌材料逐漸成為了學(xué)者們關(guān)注的熱點。本課題組前期合成了一種新型雙重抗菌材料-季銨鹽包裹溴化銀納米復(fù)合物(AgBr/BHPVP)，兼具季銨鹽接觸抗菌及銀離子緩釋性能。本研究旨在通過將其添加至樹脂基質(zhì)中，綜合評價其固化后的抗菌及機械性能，優(yōu)選出改性樹脂基質(zhì)的AgBr/BHPVP最佳添加濃度，并驗證其雙重抗菌優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

AgBr/BHPVP(本課題組自制)；變形鏈球菌UA 159(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院微生物實驗室提供)；腦心浸出液肉湯(BHI，Oxoid 公司，英國)；人工唾液(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院藥劑科提供)；活/死菌染色試劑盒(L13152，美國)；Bis-GMA、TEGDMA、樟腦醌、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)(Sigma-Aldrich，美國)；超凈工作臺(HF safe-1200型，上海力申科學(xué)儀器有限公司)；厭氧培養(yǎng)罐(8525-A 型，沈陽)；Vitek細菌比濁儀(梅里埃公司，法國)；旋渦混合器(XW-80A型，江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；微量加樣器(Eppendorf，德國)；24孔細胞培養(yǎng)板(Corning，美國)；激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)(FluoView FV1000,日本)；萬能材料試驗機(島津AGS-10kNG,日本)；顯微硬度計(HXD-1000TM，上海泰明光學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 AgBr/BHPVP的合成 通過季銨化反應(yīng)將溴己烷和2-溴乙基甲基丙烯酸酯接枝到聚-4乙烯吡啶 [poly(4-vinylpyridine)，PVP]側(cè)鏈上，合成季銨鹽甲基丙烯酸酯(quaternary ammonium methacrylates，BHPVP)。隨后，向聚合物中緩慢添加對甲苯磺酸銀(silver paratoluenesulfonate solution，AgPTS)，經(jīng)原位沉淀方法，AgBr以化學(xué)配位鍵方式結(jié)合于BHPVP側(cè)鏈上，被BHPVP聚合物包裹，通過空間位阻效應(yīng)穩(wěn)定于該聚合物中。真空干燥24 h后得到AgBr/BHPVP(圖 1)。

1.2.2 實驗菌株培養(yǎng) 復(fù)蘇變形鏈球菌UA 159，于37 ℃厭氧培養(yǎng)罐(85%N2+5%CO2+10%H2)中培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于無菌BHI瓊脂平板上，培養(yǎng)24 h后，將菌懸液比濁至0.5 MAC，以BHI液(含0.2%蔗糖)將菌懸液稀釋100倍備用。

圖 1 AgBr/BHPVP結(jié)構(gòu)圖

1.2.3 抗菌樹脂樣本制備 Bis-GMA與TEGDMA 以質(zhì)量比 1∶1 組成樹脂基質(zhì)，加入樟腦醌(引發(fā)劑)與DMAEMA(促進劑)各0.5%，磁力攪拌器混勻，避光狀態(tài)下將AgBr/BHPVP按0.5%、1.0%、1.5%質(zhì)量分數(shù)添加至樹脂基質(zhì)中作為改性組，未添加AgBr/BHPVP的樹脂基質(zhì)作為空白對照組，根據(jù)前期熱重分析結(jié)果，同時設(shè)置3 個中間對照組：0.13%AgBr(MA)、0.87%BHPVP(MB)、0.13%AgBr+0.87%BHPVP(MA+B)組，抽真空排氣泡避光保存?zhèn)溆谩７纸M配制后將樹脂充填于內(nèi)徑10 mm、高1.5 mm 的聚四氟乙烯模具中，覆蓋聚乙烯薄膜，光固化。經(jīng)水砂紙逐級打磨拋光后置37 ℃去離子水中浸泡24 h。老化3 個月樣本浸泡于人工唾液中(含0.3 mmol/L疊氮化鈉，以保證樹脂試件表面不被細菌污染)老化處理3 個月，期間，37 ℃水浴，每2 d更換1 次人工唾液。每組每個時間點樣本5 個，實驗前以70%乙醇擦拭試件表面，無菌水沖洗，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.2.5 CLSM觀察細菌活性 老化處理前后樣本與變形鏈球菌菌懸液共培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，PBS緩沖液輕柔漂洗3 次，活/死菌試劑避光染色15 min，PBS再次漂洗，樣本置CLSM下觀察細菌活性。

1.2.6 機械性能檢測

1.2.6.1 撓曲強度檢測 根據(jù)ISO 4049標(biāo)準(zhǔn)，制作規(guī)格為25 mm×2 mm×2 mm的樹脂試件，空白對照組、0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性組每組9 個，光固化后，經(jīng)600 目水砂紙打磨拋光，置37 ℃恒溫水浴24 h。精確測量各試件的寬(w)和高(h)后，于萬能試驗機進行撓曲強度測試，測試速度1 mm/min，記錄破壞載荷(F)，按照以下公式計算撓曲強度(flexural strength, FS)：FS=3FL/2wh2，其中L=20 mm, 為下加荷臺支點間距離。

1.2.6.2 維氏顯微硬度檢測 制備直徑 6 mm、高3 mm的圓柱形樹脂試件，空白對照組、0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性組每組9 個，光固化后，水砂紙逐級打磨，表面拋光呈鏡面，置37 ℃恒溫水浴24 h。于維氏顯微硬度計上以25 g載荷對樣本表面加載15 s，測試維氏顯微硬度值。每個試件隨機測試3 個點，計算均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件，單因素方差分析比較不同組間總體差異，采用 LSD(方差齊) 及Dunnett’s T3(方差不齊)法進行組間兩兩比較。檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 樹脂試件CFU計數(shù)

各組樹脂試件表面CFU計數(shù)見圖 2。老化處理前后，0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性組樹脂試件表面CFU均較空白對照組顯著降低(P<0.05)；老化3 月1.0%、1.5%組間CFU無顯著差異(P>0.05)，此外，老化處理前或處理后試件表面CFU均隨AgBr/BHPVP添加量增加而減少(P<0.05)；老化處理3 月后， 0.5%、1.5%改性組CFU數(shù)量較同組別老化處理前顯著增加(P<0.05)，1.0%改性組老化處理前后CFU數(shù)量間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖 2A)。老化處理前，MA組與MB組CFU均顯著高于1.0% AgBr/BHPVP組(P<0.05)，MA+B組與1.0% AgBr/BHPVP組之間CFU無顯著差異(P>0.05)；老化處理后，MA、 MB、MA+B組CFU數(shù)量均顯著高于1.0%AgBr/BHPVP組(P<0.05)(圖 2B)。

2.2 CLSM觀察

如圖 3所示，其中活菌染成綠色，死菌染成紅色，接近或重疊的活、死菌呈現(xiàn)橙或黃色。空白對照組樹脂試件表面覆蓋大量活細菌，呈大片綠色熒光；改性組樹脂試件表面綠色熒光減少，紅色熒光增多，即改性組樹脂試件表面黏附的活菌量明顯少于空白對照組。

2.3 機械性能的比較

各組樹脂試件撓曲強度及維氏顯微硬度的比較見圖 4。0.5%、1.0%改性組樹脂試件撓曲強度值與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)，當(dāng)AgBr/BHPVP添加量為1.5%時，撓曲強度值較空白對照組顯著降低(P<0.05)。空白對照組與改性組樹脂試件維氏顯微硬度值均無顯著性差異(P>0.05)。

圖 2 各組樹脂試件CFU的比較

3 討 論

新合成的復(fù)合抗菌材料-AgBr/BHPVP引入了丙烯酸酯功能基團，在賦予其季銨鹽接觸抗菌及緩釋銀離子雙重抗菌性能的同時，將其添加至樹脂體系中能與樹脂基質(zhì)進行化學(xué)結(jié)合，發(fā)揮穩(wěn)定、持續(xù)抗菌作用，適量添加對載體材料的機械性能無顯著影響。

季銨鹽類抗菌劑以“接觸抗菌”發(fā)揮抗菌作用[10]，帶正電荷的N+吸引帶負電荷的細菌細胞膜，通過表面離子與疏水作用與細胞膜表面相互作用，擾亂細胞膜表面電荷分布，導(dǎo)致胞膜穿孔，細胞內(nèi)容物泄露[11]。銀離子主要通過配合供電子基團協(xié)同破壞細菌關(guān)鍵細胞酶及DNA的活性，使其變性，并可與細菌細胞壁肽聚糖相互作用，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)改變，細胞壁內(nèi)陷，滲透壓增高，最終細胞死亡[12-14]。口腔內(nèi)定植的菌種眾多，其中變形鏈球菌是導(dǎo)致齲病發(fā)生的主要病原菌[15]，因此，本實驗中選取該菌用以測試改性樹脂基質(zhì)的抗菌活性。從樹脂對變形鏈球菌 UA 159的抗菌活性結(jié)果可以看出，老化處理前后改性組試件表面CFU均顯著低于空白對照組(P<0.05)。老化3 月后，0.5%、1.5%改性組CFU數(shù)量均較同組別老化前增多(P<0.05)，而1.0%改性組老化3 月后試件表面CFU較老化處理前無顯著差異(P>0.05)，從而優(yōu)選出AgBr/BHPVP添加于樹脂基質(zhì)的適宜濃度。而后，根據(jù)前期熱重分析結(jié)果，AgBr/BHPVP中AgBr質(zhì)量約占13%，故設(shè)立0.13%AgBr、0.87%BHPVP、0.13%AgBr+0.87%BHPVP 3 個中間對照組，與優(yōu)選出的1.0%AgBr/BHPVP組進行比較，進一步行老化前后對變形鏈球菌的抗菌實驗。結(jié)果顯示，除老化處理前0.13%AgBr+0.87%BHPVP 組與1.0%AgBr/BHPVP組CFU數(shù)量無顯著差異(P>0.05)外，1.0%AgBr/BHPVP組老化處理前后CFU均顯著低于各中間對照組(P<0.05)。故AgBr/BHPVP改性樹脂基質(zhì)表現(xiàn)出良好的抗菌長效性。前期實驗研究已證實AgBr/BHPVP可緩慢釋放銀離子，單體具備抗菌長效性，結(jié)合此實驗結(jié)果，可進一步說明AgBr/BHPVP添加至樹脂基質(zhì)中固化后，亦賦予載體材料持續(xù)、穩(wěn)定、長效的抗菌性能，其抗菌性能優(yōu)于單獨添加AgBr或BHPVP，以及將AgBr與BHPVP同時混合添加入樹脂基質(zhì)中。

圖 3 激光共聚焦顯微鏡觀察各組樹脂試件表面黏附的變形鏈球菌 (CLSM, ×40)

Fig 3 CLSM observation of S.mutans on the surface of resin specimens (CLSM, ×40)

圖 4 AgBr/BHPVP改性樹脂基質(zhì)機械性能的比較

Fig 4 Comparison of mechanical properties of AgBr/BHPVP modified resin matrix

樹脂修復(fù)材料在口內(nèi)行使功能時遇到的兩大挑戰(zhàn)分別是繼發(fā)齲和修復(fù)體折裂[16]。因此，除具備抗菌活性以外，材料自身剛度需達到一定程度才能保障其在口腔中良好地行使功能。撓曲強度測試相比壓縮強度測試，前者對材料亞結(jié)構(gòu)的輕微變化敏感性更高[17]，故本實驗選用撓曲強度作為評價改性后樹脂基質(zhì)機械性能的指標(biāo)之一。該實驗中，當(dāng)樹脂基質(zhì)中AgBr/BHPVP添加量為0.5%、1.0%時，撓曲強度與空白對照組間無顯著性差異(P>0.05)，且其撓曲強度值均位于80 MPa以上，符合ISO 4049標(biāo)準(zhǔn)要求[18]。但當(dāng)添加量達1.5%時，撓曲強度下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。其原因可能在于樹脂體系中過量AgBr/BHPVP與樹脂基質(zhì)間無法形成化學(xué)結(jié)合，從而形成不良接觸界面，孔隙增加，受力時易導(dǎo)致應(yīng)力集中，材料整體強度降低。硬度是衡量材料軟硬程度的指標(biāo)，常被用以表征材料的耐磨損性能。臨床上常用的Bis-GMA和TEGDMA純樹脂基質(zhì)的其維氏顯微硬度值介于100～200 MPa[19]，本研究中實驗結(jié)果顯示，利用AgBr/BHPVP對樹脂基質(zhì)進行改性，各組維氏顯微硬度值均高于100 MPa，與空白對照組接近，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，經(jīng)適量AgBr/BHPVP改性的樹脂基質(zhì)在體外對變形鏈球菌具有持續(xù)、穩(wěn)定、長效的抗菌活性，當(dāng)添加量為1.0%時，老化處理前后均表現(xiàn)出良好的抗菌活性，對材料的撓曲強度及維氏顯微硬度無不利影響，在口腔修復(fù)材料領(lǐng)域有良好應(yīng)用前景。