褪黑素-組織工程化細胞膜片-種植體復合物對骨質疏松動物骨結合影響的實驗研究

梁宏潤 秦浩 林云紅 徐倩

種植義齒現已成為恢復患者缺牙功能的可靠治療手段。骨結合作為種植義齒修復成功的金標準，是種植體承載各向負荷的物質基礎。但骨質疏松缺牙患者對口腔的影響主要表現為頜骨骨量的丟失[1]，限制了種植義齒的應用[2]。近年來，隨著國內外學者對褪黑素(melatonin，MT)研究的深入，發現與老年性骨質疏松存在一定聯系。MT可通過多種途徑[3-4]促進成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞活性，并促進骨基質的礦化成熟；同時對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stromal stem cells, BMSCs)的成骨向、成脂向分化起到重要的調節作用[5]。本研究擬通過構建骨質疏松大鼠模型，在其脛骨干骺端植入已制備好的褪黑素-骨髓間充質干細胞膜片-純鈦種植體復合物，觀察褪黑素對骨質疏松動物模型骨結合的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

2 月齡雌性SD大鼠，健康未孕，體重180～220 g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗材料

褪黑素(Sigma，美國)；成骨誘導液(配制含10%FBS，Gibco，美國)；0.2 mmol/L抗壞血酸、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉(Biosharp生物科技公司，合肥)；純鈦種植體(Φ2 mm×5 mm，深圳名揚義齒加工廠)；電動立式單柱測試臺(SJX，上海思為)；Micro-CT(ZKKS-MCT-Sharp-IV，廣州中科愷盛醫療科技有限公司)；硬組織切片機(E300CP，EXAKT公司，德國)。

1.3 制備褪黑素-骨髓間充質干細胞膜片-純鈦種植體復合物

取大鼠骨髓原代培養BMSCs，至 P2時經流式細胞儀(FACS Calibur，BD，美國)鑒定，確認后將其誘導成膜，膜片形成后經脫細胞處理、干燥、消毒，接種 P1細胞于膜片上，并置換含褪黑素的成骨誘導液和不含褪黑素的成骨誘導液，培養10 d后將膜片包裹種植體，培養4 d后備用(圖 1)。

圖 1 褪黑素-骨髓間充質干細胞膜片-純鈦種植體復合物

1.4 建立骨質疏松大鼠模型和種植體植入

隨機選取40 只大鼠分成去勢組30 只和假手術組10 只，去勢組完整切除大鼠雙側卵巢組織，假手術組僅切除大鼠卵巢周圍等體積的脂肪組織。去勢手術后8 周稱重，每組隨機抽取2 只大鼠處死，取其子宮及脛骨干骺端標本HE染色后組織學觀察。確定建模成功后將去勢組大鼠28 只，隨機分為A、B組，各組14 只，在其左右側脛骨干骺端植入實驗用種植體，A組左側脛骨記為空白對照組，植入經鈍化處理的種植體，A組右側和B組右側脛骨分別記為陽性對照組1和陽性對照組2，植入經鈍化處理的骨髓間充質干細胞膜片種植體復合物，B組左側脛骨為實驗組，植入經鈍化處理的褪黑素-骨髓間充質干細胞膜片種植體復合物。

1.5 種植體骨結合評價

種植術后第4、8周，分批處死實驗動物，每批每組隨機抽取3 只大鼠，取帶種植體的脛骨干骺端標本，經力學測試儀行種植體抗拔實驗(圖 2)，速度為2 mm/min。剩余大鼠取帶種植體的骨組織標本進行Micro-CT掃描，選取距種植體表面2 mm的區域為感興趣區域(region of interest, ROI)，對比觀察去勢組及假手術組大鼠種植體骨結合情況。掃描后的標本制作硬組織切片并行甲苯胺藍染色，觀察并計算種植體-骨結合率(bone-implant contact，BIC)。

圖 2 拉力測試示意圖

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 BMSCs表面抗原流式檢測結果

BMSCs表面分子標記物顯示CD29、CD90表達率分別為98.81%、 95.69%；CD45、CD34表達率分別為1.07%、4.40%(圖 3)。證明所培養的細胞為間充質來源的干細胞。

體重測量去勢后大鼠體重明顯高于假手術組，且變化具有統計學意義(表 1)。

Tab 1 The weight of rats before and 8 weeks after ovariectomy (g，

注： ①組間比較,P=0.031<0.05

2.2 骨質疏松模型建立后組織學觀察

術后8 周，OVX組大鼠子宮腔明顯萎縮，腺體數量明顯減少，腺腔多閉合，脛骨干骺端骨小梁出現斷裂，骨小梁數目減少，變細、稀疏而不連續；SHAM組大鼠子宮腔大小正常，腺體發達，脛骨干骺端骨小梁排列規則，連續性好(圖 4)。表明所建骨質疏松大鼠模型可靠。

圖 3 BMSCs表面抗原流式鑒定

圖 4 組織學觀察 (HE, ×40)

Fig 4 Histomorphological observation (HE, ×40)

2.3 種植體植入后生物力學測試

結果顯示，第4、8周時2 個陽性對照組植體拔出力值無差異，實驗組力值大于陽性對照組和空白對照組，且實驗組8 周時力值大于4 周時(表 2)。說明褪黑素可增加植體與骨之間的結合強度，且與植入時間呈正相關。

2.4 種植體植入后Micro-CT掃描結果

種植術后4、8 周，陽性對照組1和2植體周圍新骨形成無明顯差異，且多于空白對照組，少于實驗組。實驗組8 周時新骨形成較4周時明顯增多(圖 5)。骨形態計量學參數測定顯示，陽性對照組1和2各參數之間無統計學差異，4 周時實驗組骨小梁數量(Tb.N)、骨表面分數(BS/BV)、骨體積分數(BV/TV)明顯高于陽性對照組和空白對照組植體(P<0.05)，8周時實驗組骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)、骨表面分數(BS/BV)、骨體積分數(BV/TV)明顯高于陽性對照組和空白對照組(P<0.05)，而骨小梁間隔(Tb.Sp)與陽性對照組和空白對照組相比明顯降低(P<0.05)。說明褪黑素可促進植體周圍新骨形成，使骨小梁數目增多(表 3)。

2.5 種植體植入后組織學觀察及BIC測定結果

種植術后4、8 周，陽性對照組1和2植體周圍新生骨及類骨質無明顯差異，且多于空白對照組，少于實驗組。實驗組8 周時新生骨及類骨質較4周時明顯增多(圖 6)。骨結合率(BIC)測定結果4 周時空白組為33%，陽性對照組1為47.67%，實驗組為61.67%，陽性對照組2為46%，8 周時空白組為39.67%，陽性對照組1 為56.67%，實驗組為71.67%，陽性對照組2為55%(圖 7)。說明褪黑素可提高植體周圍骨結合率并與植入時間成正相關。

時間(周)A組左側(空白對照組)A組右側(陽性對照組1)B組左側(實驗組)B組右側(陽性對照組2)412.37±0.61①17.90±1.11②31.67±2.51①③19.57±1.30②818.23±1.24①28.13±2.14②47.30±2.10①③27.87±2.11②

注： ① 實驗組與空白對照組和陽性對照組相比,P<0.05； ② 2 個陽性對照組相比,P>0.05； ③ 實驗組8 周與4 周相比，P<0.05

圖 5 Micro-CT掃描圖

骨小梁參數時間(周)A組左側(空白對照組)A組右側(陽性對照組1)B組左側(實驗組)B組右側(陽性對照組2) BV/TV(%)412.70±0.59①22.43±0.6645.05±1.47①22.54±0.60②822.29±0.82①40.83±0.8659.17±0.56①40.66±0.48②BS/BV(%)422.90±0.15①27.51±0.5131.05±1.13①27.57±0.43②830.14±0.24①42.94±0.2750.30±1.36①42.29±0.80②Tb.Th(mm)40.076±0.003①0.086±0.0020.107±0.013①0.089±0.002②80.087±0.003①0.176±0.0480.378±0.035①0.176±0.049②Tb.N(1/mm)41.561±0.139①3.602±0.1444.891±0.122①3.661±0.105②82.523±0.338①5.246±0.0806.780±0.107①5.439±0.276②Tb.Sp(mm)40.137±0.036①0.095±0.0050.067±0.003①0.086±0.006②80.101±0.006①0.070±0.0010.041±0.003①0.072±0.004②

注： BV/TV： 骨體積分數； BS/BV： 骨表面分數； Tb.Th： 骨小梁厚度； Tb.N： 骨小梁數量； Tb.Sp： 骨小梁間隔； ① 實驗組與空白組和陽性對照組相比，P<0.05； ② 2 個陽性對照組相比，P>0.05

3 討 論

種植義齒修復成功的主要標志之一是種植體與骨組織之間形成良好的骨結合，種植部位的骨量和骨質是影響種植體骨結合的重要因素。我國現已進入老齡化社會，骨質疏松癥患者日益增多，骨質和骨量缺陷將影響骨組織對種植體的支持，延長愈合時間，從而影響種植體骨結合，容易造成種植體松動、脫落，甚至可能導致種植的失敗[6-8]。因此，骨質疏松癥是現在公認的牙種植修復的危險因素之一[9-10]，為了滿足骨質疏松患者對種植牙的需求，提高骨質疏松患者種植義齒成功率具有重要的意義。

目前，對骨質疏松患者行牙種植治療時，常輔助藥物治療或在種植手術時采用骨擠壓等方法來改善種植體的骨密度。然而，骨擠壓雖在一定程度上可增加局部骨密度，提高種植體初期穩定性，但也有學者指出，骨擠壓的過程實際上是對骨孔周圍骨小梁的破壞，對于骨質疏松缺牙患者，該技術對種植體的早期骨結合并沒有促進作用，甚至可能有潛在的不良影響，其遠期效果還有待于觀察[11-12]。藥物治療包括雌激素、甲狀旁腺激素等，但這些藥物仍以抑制過分骨吸收為主，作用途徑較單一、作用效果也有限，而且在療效和安全性上，沒有充足的依據表明哪種藥物更好[13]。

圖 6 甲苯胺藍染色 (×100)

Fig 6 Toluidine blue staining (×100)

圖 7 各組大鼠種植體骨結合率

褪黑素是一種普遍存在于多種生物體內的激素，主要是由哺乳動物和人類的松果體產生，具有促進睡眠、調節時差、抗衰老、調節免疫、抗腫瘤等多項生理功能。近年來發現褪黑素和老年性骨質疏松存在著某種聯系，隨著人年齡的增長，血清中的褪黑素水平有下降趨勢，骨質疏松的發生幾率逐漸增加且被證明與褪黑素下降有關[14]。年齡超過50 歲的人體內褪黑素的血清學水平顯著低于青春發育期的人群[15]。骨代謝的變化決定著骨質疏松的發生、發展，在骨代謝方面，褪黑素可通過多種途徑促進成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞活性，并促進骨基質的礦化成熟；同時對BMSCs的成骨向、成脂向分化也起到重要的調節作用。有研究指出，在兔的脛骨組織植入鈦種植體之后，相較于沒有添加褪黑素的對照組，添加褪黑素的植體周圍新骨能夠迅速的形成[16]，因此褪黑素促進成骨的作用已被證實。

本實驗將褪黑素-組織工程化細胞膜片與種植體復合后植入骨質疏松大鼠體內，在生物力學、骨組織學和骨計量學指標上觀察到，種植術后第4、8周，復合了褪黑素-組織工程化細胞膜片的種植體組骨結合強度顯著高于沒有復合褪黑素的細胞膜片種植體組及未復合膜片的種植體組；術后4 周和8 周時均可觀察到復合了褪黑素-組織工程化細胞膜片的種植體周圍新骨形成較多，骨密度，骨小梁數目、厚度及種植體骨結合率均顯著高于沒有復合褪黑素的細胞膜片種植體組和未復合膜片的種植體組；同時隨著植入時間的延長，即8 周時復合了褪黑素的種植體周圍的骨小梁數目和單位骨量與4 周時相比逐漸增加，種植體骨結合強度和骨結合率也有顯著提高。正是利用了褪黑素對骨代謝的調節，促進成骨細胞增殖分化，抑制破骨細胞活性，促進骨基質礦化成熟，同時對BMSCs成骨誘導的作用，使其新骨形成增多，骨密度增高，促進骨愈合，進而使骨結合強度增高，骨結合率增大，且隨植入時間的延長骨結合強度和骨結合率都相應增加。由于種植體周圍骨質量的改善，提高了種植體骨結合率，從而為種植體提供良好的支持作用。褪黑素可加快骨形成速度、縮短骨改建的時間、促進骨組織礦化、加強周圍骨組織的支持作用，改善骨質疏松狀態對種植體骨結合的不利影響，從而有利于提高種植體的成功率。

褪黑素作為目前臨床治療骨質疏松的一種潛在藥物，其作用機制與成骨效果會越來越受到臨床醫生與科研人員的關注和重視。而其在骨質疏松狀態下行種植修復時的應用，對于加速種植術后的種植體早期骨整合，增加種植體的骨結合強度及改善種植體周圍骨質量，提高骨質疏松患者的種植成功率等，有著極為重要的意義。本實驗將褪黑素這種潛在的抗骨質疏松藥，利用組織工程的方法來承載，并將其局部應用于骨質疏松種植領域，具有一定的創新性，為將褪黑素應用于骨質疏松缺牙患者，提高其種植成功率提供科學合理的實驗依據和理論支持，但實驗中所用植體并非現有種植系統中的任何一種，因此后期可以設計結合某個種植系統的植體進行相關實驗，并探討更多褪黑素局部應用于種植體骨結合的方法。

4 結 論

褪黑素-組織工程化細胞膜片-種植體復合物能增加骨質疏松大鼠植體周圍骨密度，改善骨結構，增強種植體與骨組織結合的強度，使種植體周圍新生骨和類骨質增多，種植體骨結合率增加，促進骨改建，從而提高種植體骨結合的質量，且種植體骨結合強度和骨結合率均隨植入時間延長不斷提高。