白花丹素通過PI3K/AKT/mTOR通路增強(qiáng)PF方案殺傷舌鱗癌細(xì)胞

周凡 潘淑婷 邱嘉旋

舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔癌中最常見的惡性腫瘤，其惡性程度較高且容易復(fù)發(fā)[1]。新輔助化療PF方案，即手術(shù)或放療前采用順鉑+5-氟尿嘧啶化療，是舌鱗癌綜合治療的重要部分，能提高患者生活質(zhì)量和遠(yuǎn)期生存率[2]。但仍有部分腫瘤對化療藥物不敏感并出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重影響其療效[3]。細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種依賴溶酶體降解途徑，它是不同于凋亡的一種II型程序性死亡方式，可通過吞噬、降解細(xì)胞內(nèi)損傷、衰老的蛋白或器官維持基因完整性和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬活性改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。少量的細(xì)胞自噬可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞存活，過量的細(xì)胞自噬可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡[5]。

白花丹素是從白花丹根莖中分離的一種醌類成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種生物活性[6]。對多種腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，對正常細(xì)胞無明顯毒性[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白花丹素能夠增強(qiáng)術(shù)前PF化療方案對舌鱗癌細(xì)胞的殺傷作用[8]，其作用機(jī)制尚未報道，本研究探討白花丹素對PF化療方案殺傷舌鱗癌CAL27細(xì)胞凋亡和自噬的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基(12100-500)、MTT(M8180)、DMSO(D8370)、蛋白提取試劑盒(PC0020)(北京索萊寶公司)；胎牛血清(TBD 11-HT，TBD生物公司)；白花丹素(481-42-5，Sigma公司，美國)；順鉑(國藥準(zhǔn)字H37021358，山東齊魯制藥廠)；5-氟尿嘧啶(國藥準(zhǔn)字H32022246，南通精華制藥有限公司)；IGF-1(100-11-100)、β-actin一抗(14439-1-AP)(Proteintech公司，美國)；MHY1484(HY-B0795，MCE?，美國)；凋亡試劑盒(KGA106，南京凱基生物有限公司)；Cyto-ID?自噬檢測試劑盒(ENZ-51031-0050，ENZO公司，美國)；Beclin1(3495S)、LC3B(3868S)、PI3K(4249)、AKT(4691S)、p-AKT(Ser473)(4060)、mTOR(2983T)、p-mTOR (Ser2448)一抗(5536)(CST公司，美國)；山羊抗兔二抗(ZB-2301、中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 舌癌細(xì)胞系CAL27(由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室凍存提供)；CAL27細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)中貼壁生長，于37 ℃、100%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)80%左右，用含有0.05% EDTA及0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期CAL27細(xì)胞以5 000 個/孔接種于96 孔板中，每孔180 μL，待細(xì)胞貼壁生長后，設(shè)對照組、PB組(3.5 μmol/L)、PF組(順鉑2.5 μg/ml、5-氟尿嘧啶320 μg/ml)、PB+PF組(PB3.5 μmol/L、順鉑2.5 μg/ml、5-氟尿嘧啶320 μg/ml)。每組設(shè)5 個平行復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl新鮮配置的0.5%MTT試劑，避光作用4 h后，小心棄上清，加入100 μl DMSO/孔，避光搖勻15 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定各孔的吸光度A值。根據(jù)公式：存活率(%)=[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%；抑制率(IR)：IR=1-存活率；計(jì)算每組細(xì)胞存活率及抑制率。PB聯(lián)合PF用藥的細(xì)胞抑制率按照金氏公式[9]判斷：Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，[其中E(a+b)為 PB +PF時的抑制率，Ea、Eb分別為 PB和PF單獨(dú)作用時的抑制率]。0.85≤Q<1.15為兩藥相加作用，Q≥1.15為兩藥協(xié)同作用，Q<0.85為兩藥拮抗作用。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)期CAL27細(xì)胞按3×105個/孔接種于6孔板中，次日，按不同分組加藥處理24 h后，收集懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞，根據(jù)流式凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，AnnexinV-FITC/PI雙染色，室溫下避光染色15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。Flowjo 7.6軟件分析Annexin V/PI陽性細(xì)胞所占百分率即細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Cyto-ID熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬 取對數(shù)期CAL27細(xì)胞按一定細(xì)胞數(shù)量接種于含載玻片的24 孔板中，37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁60%后進(jìn)行藥物干預(yù)繼續(xù)作用24 h。加入Cyto ID和Hoechst 33342染色，熒光顯微鏡下(放大倍數(shù)為40)觀察自噬并拍照。采用Image J軟件對圖像進(jìn)行分析，隨機(jī)選取4 個面積等大的視野，計(jì)算熒光吸光度平均值。

1.2.5 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白及信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 對數(shù)期CAL27細(xì)胞經(jīng)不同條件處理后，提取各組細(xì)胞蛋白，測定蛋白濃度，于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩Ｅ渲?%～12%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉或5%BSA室溫封閉2 h，一抗[Beclin1、LC3B(均1∶1 000)；PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR、p-mTOR(均1∶500)]4 ℃孵育過夜，TBST洗膜8 min×3，二抗[山羊抗兔(1∶6 000～2 000)]室溫孵育1 h，TBST洗膜8 min×3，加入顯影液，采用Bio-Rad ChemiDocTM XRS電子顯像系統(tǒng)顯影采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PB聯(lián)合PF方案對CAL27細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PB聯(lián)合PF組較單獨(dú)應(yīng)用PF方案，其對CAL27細(xì)胞24 h抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且聯(lián)合用藥24 h時計(jì)算Q值為1.167>1.15，提示PB增強(qiáng)了PF方案對舌鱗癌細(xì)胞的增殖抑制作用(表 1)。

2.2 PB增強(qiáng)PF方案對CAL27細(xì)胞的凋亡作用

流式細(xì)胞儀結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同藥物組作用于CAL27細(xì)胞24 h后，PB聯(lián)合PF較單獨(dú)應(yīng)用PF方案，其細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.001)(圖 1)。

圖 1 不同藥物組對CAL27細(xì)胞凋亡率的影響

Tab 1 Inhibition of the proliferation of CAL27 cells by various treatments

組別細(xì)胞抑制率(%)(24 h)對照組0PB組17.25±3.862PF組26.00±2.582PB+PF組45.25±4.349

2.3 PB增強(qiáng)PF方案對CAL27細(xì)胞的自噬作用

2.3.1 Western Blot檢測CAL27細(xì)胞中Beclin1、LC3的表達(dá) 在CAL27細(xì)胞中，PB組較空白組、PB+PF組較PF組比較，細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)水平上調(diào)，且LC3II/LC3I的比值也升高(P<0.001)，提示PB能夠增強(qiáng)PF方案化療CAL27細(xì)胞的自噬作用(圖 2)。

2.3.2 Cyto ID熒光顯微鏡檢測自噬水平 Cyto ID熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PB單獨(dú)作用時，CAL27細(xì)胞內(nèi)自噬率較空白組增加，而PB+PF組較單獨(dú)PF組比較，細(xì)胞內(nèi)自噬率亦明顯增多(P<0.001)。結(jié)果同樣表明PB能夠增強(qiáng)PF方案化療CAL27細(xì)胞的自噬作用(圖 3)。

圖 2 不同藥物組對CAL27細(xì)胞中Beclin1、LC3蛋白的影響

圖 3 不同藥物組對 CAL27細(xì)胞的自噬水平的影響

2.4 PB通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)PF化療舌鱗癌CAL27細(xì)胞的凋亡和自噬

2.4.1 白花丹素下調(diào)PF化療CAL27細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達(dá) Western blot檢測結(jié)果示，PB組較空白組比較，CAL27細(xì)胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)均不同程度降低(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組PB+PF較單獨(dú)PF組比較，細(xì)胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。提示白花丹素能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路(圖 4)。

2.4.2 PI3K/AKT/mTOR激動劑能夠抑制白花丹素誘導(dǎo)PF化療CAL27細(xì)胞的凋亡和自噬 我們采用PI3K/AKT激動劑IGF-1(10 ng/ml)、mTOR激動劑MHY1485(10 μmol/L)分別預(yù)處理細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)分為空白組、IGF-1組、MHY1485組、PB+PF組、IGF-1+PB+PF組、MHY1485+PB+PF組，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡(圖 5)、Cyto ID熒光顯微鏡檢測自噬水平(圖 6)，Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白及信號通路磷酸化水平蛋白(圖 7)，結(jié)果顯示，PB+PF組分別聯(lián)合IGF-1 、MHY1485作用時，較PB+PF作用組，CAL27細(xì)胞凋亡與自噬均有不同程度減少(P<0.001)。同時加入激動劑組不同程度逆轉(zhuǎn)了PB對PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.05)(圖 7)。

圖 4 不同藥物組對CAL27細(xì)胞中信號通路蛋白表達(dá)的影響

圖 5 PI3K/AKT/mTOR激動劑作用后對PB誘導(dǎo)PF化療CAL27細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

舌鱗癌是口腔癌中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，有效的術(shù)前化療能夠很大程度提高其遠(yuǎn)期生存率[10-11]，PF化療方案是舌鱗癌綜合治療的重要部分，白花丹素能增強(qiáng)其療效[8]。細(xì)胞凋亡作為腫瘤細(xì)胞死亡的一種機(jī)制，近年來自噬被認(rèn)為是預(yù)防和治療腫瘤的重要靶點(diǎn)[12]，自噬是一種高度保守的細(xì)胞行為，參與細(xì)胞器降解與再利用過程，與細(xì)胞的生長、增殖及腫瘤的發(fā)生過程密切相關(guān)。Beclin1、LC3是檢測自噬標(biāo)志性蛋白。在腫瘤化療過程中，當(dāng)自噬達(dá)到一定程度時可發(fā)生自噬性死亡，對殺死腫瘤細(xì)胞具有重要作用[13]。

白花丹素是中草藥白花丹的主要活性成分，有研究者表明，白花丹素在腫瘤細(xì)胞和動物模型中具有促凋亡[14]及促自噬性死亡[15]的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)白花丹素能夠增強(qiáng)術(shù)前PF方案對舌鱗癌細(xì)胞的殺傷作用[8]，且與PI3K/AKT/mTOR通路蛋白有關(guān)[16]。在本實(shí)驗(yàn)PF方案化療CAL27細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組PB聯(lián)合PF方案較單獨(dú)應(yīng)用PF方案，其凋亡率明顯增加，且細(xì)胞中Beclin1、LC3蛋白表達(dá)均不同程度上調(diào)，提示白花丹素增強(qiáng)PF方案殺傷CAL27細(xì)胞的過程中不僅細(xì)胞凋亡增加，且自噬作用亦增強(qiáng)從而發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡。

圖 6 PI3K/AKT/mTOR激動劑作用后對PB誘導(dǎo)PF化療CAL27細(xì)胞自噬的影響 (×40)

Fig 6 The effects of PI3K/AKT/mTOR activitors on the autophagy of CAL27 cells induced by PB in PF chemotherapy (×40)

圖 7 PI3K/AKT/mTOR激動劑作用后自噬及信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Fig 7 The effects of PI3K/AKT/mTOR activitors on autophagy and signaling pathway related proteins expression

PI3K/AKT/mTOR是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生有著重要的關(guān)系[17-18]，參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡、存活、增殖、生長、分化、代謝遷移和血管生成[19]。研究表明白花丹素可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞[15]、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[20]凋亡和自噬。通過Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PB聯(lián)合PF方案較單獨(dú)PF方案作用，其CAL27細(xì)胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低，提示PB能夠抑制CAL27細(xì)胞中PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)從而抑制PI3K/AKT/mTOR通路。為求進(jìn)一步驗(yàn)證，PB是否是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路從而誘導(dǎo)PF方案化療舌鱗癌CAL27細(xì)胞凋亡和自噬，分別采用PI3K/AKT激動劑IGF-1(10 ng/ml)、mTOR激動劑MHY1485(10 μmol/L)來激活該通路，結(jié)果顯示，PB+PF組加入IGF-I、MHY1485后其CAL27細(xì)胞的凋亡率一定程度下降，Beclin1、LC3蛋白表達(dá)下調(diào)。而原本在PB+PF組中，白花丹素對PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的下調(diào)作用減弱，提示IGF-1、MHY1485逆轉(zhuǎn)了PB對PF化療CAL27細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)白花丹素能夠增強(qiáng)術(shù)前PF方案對CAL27細(xì)胞的殺傷作用，上述過程同時誘導(dǎo)PF方案對CAL27細(xì)胞的凋亡和自噬作用，且白花丹素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路來發(fā)揮作用。