葉酸殼聚糖納米粒攜帶DAC影響SCC-9細胞p16基因甲基化狀態的意義

劉雪瑩 彭歡 林曦 徐華生 黃旋平

p16 基因已被證實參與了細胞的周期調控，腫瘤的發生與其失活導致相關蛋白蛋白合成減少密不可分。p16基因甲基化是p16基因失活的主要方式，造成了腫瘤的發生。該文在實驗中選擇了具有逆甲基化及抑制甲基化的5-氮-2’-脫氧胞苷(地西他濱,DAC)，未配備載藥系統的DAC有效性差，主動吸附靶標的幾率小。葉酸受體被證實大量存在于惡性腫瘤細胞中，所以鑒于這些特點利用葉酸殼聚糖納米顆粒攜DAC以提高有效性。本實驗探索葉酸-殼聚糖攜DAC納米粒對比DAC作用于人鱗狀上皮舌癌細胞SCC-9細胞p16基因甲基化還原效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SCC-9細胞(上海酶研生物科技有限公司)；DAC(上海源葉生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司,日本);甲基化熒光PCR試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)、p16基因引物(大連寶生物公司)；Human β-actin (北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；一抗p16/mts1抗體、二抗兔抗人kit、DAB顯色劑(中衫生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養

10%血清DEMN培養基，貼壁培養SCC-9細胞培養于37 ℃、5%CO2培養箱，2～3 d換液并適時傳代，待其處于生長對數期備用。

1.3 葉酸殼聚糖載藥DAC納米顆粒制備

100 mg葉酸加合適劑量的蒸餾水，攪動下逐滴加入氨水；0.45 μm濾膜過濾，蒸餾水定容至100 ml，得葉酸氨鹽溶液。400 mg殼聚糖加合適劑量的蒸餾水與2 ml冰醋酸磁力攪拌，醋酸的濃度應為1%。0.45 μm濾膜過濾與蒸餾水配至200 ml獲2 mg/ml殼聚糖醋酸。合適劑量DAC與已配置的200 ml的殼聚糖醋酸液混合以1 000 r/min速度磁力下進行攪拌，加入50 ml葉酸氨鹽溶液與20 ml 2 mg/ml三聚磷酸鈉溶液，均按1 滴/s的速度，獲得載藥地西他濱的葉酸-殼聚糖納米粒水分散體系。合理稀釋，用Malvern ZETASIZER NANO檢測其粒徑和電位，平均粒徑為212 nm，電位均值為30.8 mV，證實其為穩定的納米粒子。

1.4 實驗分組

將體外培養的SCC-9細胞分為0、1、2、3、4、5、6組，其中1、2、3組選用3 個梯度濃度1×10-7mol/ L、1×10-6mol/ L、1×10-5mol/L的DAC進行處理細胞，4、5、6組采用同樣3 個濃度梯度葉酸殼聚糖載藥DAC納米粒處理細胞，0組為空白對照組。

1.5 p16基因mRNA的表達

依照實驗說明書所示步驟提取各組藥物處理了的Total RNA，反轉錄試劑盒說明步驟合成Real-time PCR反應用模版cDNA。p16基因mRNA上游引物序列：5’-CCCCACTACCGTAAATG TCCA-3’下游引物序列：5’-TGCTCACTCCAGAAAACTCCAA-3’。內參β-actin引物序列正義鏈引物序列：5’-GCCTCGCTGTCCACCTTCCA-3’反義鏈引物序列：5’-CACCTTCACCGTTCC AGTTT-3’。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共循環40 次，72 ℃延伸5 min。溶解曲線反應體系以PCR儀器的推薦體系設定。用ΔΔCt法處理結果，ΔΔCt=Ct實驗組(Ct實驗組p16-Ct實驗組β-actin)-ΔCt空白對照組(Ct空白對照組p16-Ct空白對照組β-actin)。2-ΔΔct>1即為目的基因高表達。

1.6 p16蛋白表達

各組按劑量放入培養基內在孔板內培養細胞48 h。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3 次，浸泡0.1%Triton-x-100室溫10 min，PBS洗3 次后滴中杉封閉血清37 ℃孵育15 min，傾去。滴加一抗、二抗。空白對照組分為2 組分別滴加一抗、二抗及PBS。DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色)約3～10 min，蒸餾水洗2 次，蘇木素復染0.5～1 min，水洗 30 min，樹膠封片。鏡下隨取12 個100 倍視野，根據細胞染色計分，棕褐色3 分，黃色2 分，淺黃色1 分，無色0 分，≥70%記3 分，30%～69%記2 分，1%～29%記1 分，無為0 分。分數相加為結果：0 分為陰性；1～2 分為低表達；3 分以上為高表達。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC與DAC作用SCC-9細胞后p16基因mRNA表達

藥物作用48 h后，實驗組均2-ΔΔcr>1 (P<0.05)，葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC組的p16基因mRNA的表達與DAC組相比有著明顯差異(P<0.05)，表明葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC在一定程度上，更有效的上調了p16基因的表達(表 1)。Real-time PCR SCC-9細胞p16基因mRNA實時熒光定量PCR擴增曲線圖(圖 1)和SCC-9細胞p16基因mRNA實時熒光定量PCR擴增曲線(圖 2)，排除非特異性擴增及引物二聚體。實驗組加藥后SCC-9細胞p16基因表達2-ΔΔct值和各實驗組加藥48 h后p16基因的mRNA相對表達量(表 1)。

藥 物 濃 度2-ΔΔct值DAC處理48 h 1×10-7 mol/L3.58±0.15DAC處理48 h 1×10-6 mol/L20.88±0.11DAC處理48 h 1×10-5 mol/L5.89±0.23載藥DAC處理48 h 1×10-7 mol/L9.12±0.13載藥DAC處理48 h 1×10-6 mol/L23.96±0.24載藥DAC處理48 h 1×10-5 mol/L10.12±0.18未加藥DAC處理48 h1

2.2 加藥作用SCC-9細胞后p16蛋白免疫組化結果(×100倍)

p16基因細胞核或細胞質呈棕黃色為p16蛋白的陽性表達,4、5組較相同濃度的1、2組p16蛋白均呈高表達狀態， 即在1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L 3 個濃度下， 1×10-7mol/L、1×10-6mol/L葉酸殼聚糖納米粒載藥DAC對比相對應濃度的DAC組呈強陽性表達，1×10-5mol/L對照組葉酸殼聚糖納米粒載藥DAC對比相同濃度的DAC組為弱陽性表達，空白組為陰性表達(圖 3)。

圖 1 SCC-9細胞p16基因mRNA實時熒光定量PCR擴增曲線 圖 2 SCC-9細胞p16基因mRNA實時熒光定量PCR溶解曲線

Fig 1 p16 gene mRNA Real-time PCR amplification curve of SCC-9 cells Fig 2 p16 gene mRNA Real-time PCR melt curve of SCC-9 cells

圖 3 SCC-9細胞p16蛋白陽性表達 (IHC, ×100)

Fig 3 The expression of p16 protein in SCC-9 cells (IHC, ×100)

3 討 論

目前惡性腫瘤的發病率居高不下[1]，Serrano等[2]證明了p16基因的產物的減少會導致細胞進入無限增殖，是細胞生長關鍵因子。p16基因甲基化引起了轉錄失活導致p16產物表達可減弱甚至消失極大地增加腫瘤發生的可能[3]。DNA甲基化修飾是DNA去甲基化酶與DNMT通過正負調控共同維持的一種動態平衡的DNA甲基化模式。已有研究證明在癌細胞系中，去甲基化試劑可以使高甲基化表達的基因去甲基化從而恢復表達[4]。5-aza-CdR ，即DAC(decit-abine)，誘導DNA基因去甲基化，促進啟動子區域的去甲基化[5]。但現在地西他濱用藥有效性差，靶向性弱，主動吸附靶標的幾率小，化療毒副作用強，因此造成患者心理和身體的雙重折磨。

殼聚糖因其良好的生物兼容性，無免疫原性并且具有優良的黏膜粘附特性[6]，因此制備多種殼聚糖衍生物藥物運載系統等范疇有著光明的應用遠景[7-8]。葉酸(FA)是很多生物所需的一種必要維他命，葉酸受體在多數惡性腫瘤細胞膜內大量存在，遠遠高于普通細胞[9]，這種受體是錨在膜上一種通過聚糖磷脂酰肌醇(GPI)，是具有高度特異的親合性的糖蛋白，具有將葉酸通過吞噬作用在生理條件下攝取入細胞內能力。所以鑒于這些特點將葉酸殼聚糖載藥納米顆粒作為抗腫瘤藥物的載藥系統以便提高有效性。Ji等[10]報道了利用葉酸-共軛殼聚糖包覆卡鉑用于治療宮頸癌，結果顯示該載藥系統具有更加優越的靶向細胞毒性，提示我們該載藥系統在舌癌治療方面很可能具有治療價值。

本課題組已證實DAC可以促使p16基因逆甲基化從而恢復活性重新編碼p16蛋白[11]。本實驗通過Real-time PCR檢測p16基因mRNA表達結果顯示，經過葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC組和DAC組處理48 h后，葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC組p16基因mRNA呈高表達，相對表達量RQ值均大于1，各葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC組分別與相同濃度下DAC組進行t檢驗(均P<0.05)，差異有統計學意義。因此可以推斷，在SCC-9細胞中，p16基因為高甲基化狀態，葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC更有效的促使部分p16基因發生了去甲基化作用，使其重新恢復了活性，從而上調了mRNA的表達。本實驗中免疫組化結果顯示，葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC與DAC作用培養48 h后的SCC-9細胞，其p16蛋白實驗組均呈高表達狀態，葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC組相較于未配備載藥系統組更是呈強陽性表達，這與p16基因表達的改變相對應。

本次實驗證實了葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC更有效的發揮了DAC的去甲基化作用，且葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC組對比DAC組在SCC-9細胞中p16基因的蛋白及mRNA表達均增高。可以認為葉酸殼聚糖納米顆粒載藥DAC更有效的利用了甲基化轉移酶抑制原理，對舌癌的治療具有指導意義。