探討免疫組化檢測腦膠質瘤IDH1及應用

王玉環

源自神經上皮的腫瘤統稱為腦膠質瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%[1]，是最常見的顱內惡性腫瘤，年發病率為3～8人/10萬人口[2]。腦膠質瘤在臨床上具有發病率高、復發率高、死亡率高、治愈率低的特點[3]。目前，腦膠質瘤的治療手段以手術切除為主，術后輔助以放療、化療等手段，預后不佳[4]。IDH1是三羧酸循環中重要的關鍵限速酶[5]，催化異檸檬酸氧化脫羧生成二氧化碳及α-酮戊二酸（α-KG），可為細胞新陳代謝提供能量和生物合成前體物質[6]。近年來，Parsons等[7]學者研究發現IDH1的異常表達與膠質瘤的發生密切相關，并且在膠質瘤的診斷、治療、預后有重要意義。本文以膠質瘤作為研究樣本，通過Ventana Bench Mark ULTRA 全自動免疫組化染色法及手工免疫組化SP染色法了解IDH1突變情況，探索IDH1突變與膠質瘤發展及其預后間的關系，為膠質瘤診斷與治療提供理論依據，并為今后的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年1月—2018年4月廈門大學附屬第一醫院手術切除的13例經病理學診斷為膠質瘤的腫瘤標本組織。13例患者術前均未接受藥物化療、放射治療等其他治療，并且排除合并其他全身性疾病。組織病理標本由我科經驗豐富的主治醫師取材，然后經固定、脫水、石蠟、包埋（制成蠟塊）、切片、染色并詳細篩選、復核后明確診斷為膠質瘤。

1.2 試劑

即用型鼠抗人IDH1R132H單克隆抗體（克隆號：H09）， 購自福州邁新生科技術開發有限公司。ventana Bench Mark ULTRA全自動免疫組化儀上的試劑包括：DAB試劑盒（包含Ultra View Universal DAB inhibitor、Ultra View Universal HRP Multimer、Ultra View Universal DAB Chtomogen、Ultra View Universal DAB H2O2、Ultra ViewUniversal DAB Copper），脫蠟液（EzPrep），抗原修復液（CC1，pH8.5 Tris-EDTA），液體封蓋膜（LCS），蘇木精染液，靛藍染色液，清洗緩沖液（Reaction Buffer），緩沖液（SSC），以上試劑均購自羅氏診斷產品（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

每例膠質瘤病例取一塊帶有腫瘤的蠟塊，連續切片2張，切片厚約4 μm，黏貼于帶陽性對照的防脫載玻片上，60℃烤片1 h。切片內正常腦組織表達陰性為內對照。分別采用ventana Bench Mark ULTRA全自動免疫組化儀（實驗組）與手工免疫組化SP染色法（對照組）進行IDH1免疫組織化學檢測。結果判斷標準：IDH1陽性信號定位于細胞漿。

2 結果

2.1 實驗組結果

染色強度強、著色均勻、陽性定位準確、背景清晰、干凈、無非特異染、結果容易判讀，見圖1。結果顯示IDHl表達陰性6例，陽性7例。

2.2 對照組結果

染色強度較弱、著色欠均勻、陽性定位不準確、背景不清晰、有非特異染色、結果判讀受干擾，見圖2。結果顯示IDH1表達陰性6例，陽性7例。

3 討論

IDHI是體內重要的氧化還原酶，是三羧酸循環的關鍵酶之一[8]。IDH1 突變后會催化α- 酮戊二酸還原為2- 羥基戊二酸，2-羥基戊二酸作為IDH 突變后生成的代謝廢物[9]，一般在人體細胞中含量很低，如果大量存在，會直接抑制人體內組蛋白去甲基化酶與DNA 去甲基化酶等的多個重要雙加氧酶的活力[10]，改變細胞的生長方式和增值，進而誘發腫瘤[11]。科學研究發現IDH1基因突變與膠質瘤的發生發展、預后有密切關系后，IDH1基因突變的檢測成為了膠質瘤患者常規檢查項目之一[12]。本實驗所用的克隆號為H09的IDH1，可特異性地檢測R132H類型的點突變。本研究表明：手工免疫組化SP染色法檢測結果一致。

圖1 實驗組IDH1陽性（×40）

圖2 對照組IDH1陽性（×40）

免疫組化染色法從手工操作發展到半自動免疫組化儀再到全自動免疫組化儀操作，節省了人力成本和時間。手工免疫組化SP染色影響因素很多，例如抗體修復程度的把握，一抗孵育時間和溫度控制，且整個染色過程時間較長，一般需要4～24 h不等，如果大批量的操作，費時費力。而全自動免疫組化染色儀從脫蠟開始、孵育、抗原修復、抗體滴加、孵育、DAB顯色完成整個過程都在線完成，通過軟件準確控制所有試劑的孵育時間和溫度，染色結果穩定。作者在同一張待測片上黏貼陽性對照片，陽性對照與待檢測組織在同一張切片上進行染色，實現了實驗條件的一致性，同時有陽性對照和陰性內對照，達到了免疫組化染色的標準化，增加了染色結果準確性。此外切片也可直接歸檔保存，不需要單獨保存陽性對照切片，一舉兩得。作者通過對比實驗，發現全自動免疫組化染色儀染色較手工法陽性表達定位準確、著色均勻、背景清晰、無非特異染色，并且操作簡單、運行時間短，可以批量化操作大大節省了勞動力，提高了工作效率。機子所有的廢液都回收，不直接排放，節能環保。

通過對IDH1 免疫組化染色結果的分析，作者發現突變只發生于腫瘤細胞自身，正常的血液細胞、內皮細胞等無染色。IDH1染色強度與腫瘤細胞級別無關。WHOⅡ級的彌漫性星形細胞瘤，WHOIII級的間變性星形細胞瘤，或者WHOIV級的膠質母細胞瘤，IDH1突變陽性的腫瘤細胞并沒有隨著腫瘤級別的進展而增加，不呈正相關的關系。

綜上所述，全自動免疫組化染色儀染色較手工法陽性表達定位準確、著色均勻、背景清晰、無非特異染色，并且操作簡單、運行時間短，可以批量化操作，大大節省了勞動力，提高了工作效率。推薦全自動免疫組化法作為臨床檢測IDH1基因突變的首選方法。