紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜特點(diǎn)分析

魏影 郭妍 柏柳 陳艷麗 黃嶸赫 余治健 鄧啟文 李桂秋

腸球菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)重要的正常菌群，近年腸球茵屬細(xì)菌引發(fā)的感染不斷增加，糞腸球菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一[1-4]。生物膜形成是細(xì)菌耐藥的重要原因之一，生物膜形成也是糞腸球菌的重要特點(diǎn)，以往我們的研究表明其陽性率超過50%，即使是一些非耐藥的腸球菌也能形成難以根除的生物膜。近年紅霉素耐藥糞腸球菌已經(jīng)成為較高的比例，紅霉素耐藥糞腸球菌在我國主要有erm基因介導(dǎo)耐藥傳播，多種G+細(xì)菌已經(jīng)報(bào)道紅霉素耐藥株具有克隆聚集性和不同的耐藥特點(diǎn)，然而紅霉素耐藥糞腸球菌的分子特點(diǎn)和生物膜形成特點(diǎn)仍無報(bào)道。多個(gè)毒性因素與糞腸球菌生物膜的形成有關(guān)，糞腸腸球菌的毒力因子有聚類物質(zhì)、表面蛋白、細(xì)胞溶解素、明膠酶E、透明質(zhì)酸酶、信息素誘導(dǎo)蛋白、膠原結(jié)合蛋白、心內(nèi)膜炎抗原及信息素等[5-8]。紅霉素耐藥糞腸球菌中這些毒力因子的分布尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)主要探討紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成特點(diǎn)與毒力基因和耐藥基因特點(diǎn)之間的關(guān)系，分析該類細(xì)菌生物膜形成特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集251株自深圳市南山醫(yī)院2010年1月—2017年6月分離自患者標(biāo)本的糞腸球菌，質(zhì)控菌株是糞腸球菌菌株ATCC29212和OG1RF （ATCC47077）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 采用BD Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，主要藥物包括阿米卡星（丁胺卡那霉素）、氨芐西林、苯唑西林、復(fù)方磺胺、紅霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐胺嘧啶、利福平、利奈唑胺、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、替考拉寧、頭孢西丁、萬古霉素、呋喃妥因。采用2017年版美國臨床和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法再次確認(rèn)紅霉素耐藥標(biāo)準(zhǔn)，以糞腸球菌ATCC29212作為質(zhì)控菌株。紅霉素敏感、中介和耐藥的MIC值定義為MIC≤0.5 mg/L、MIC 1～4 mg/L 和 MIC ≥ 8 mg/L。

1.2.2 毒力基因的檢測 毒力基因引物由北京六合華大基因公司合成[9-10]。按試劑盒說明提取菌株基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肞CR檢測毒力基因。PCR體系（50 μl）：Dream Taq Green PCR Master Mix（2×） 25 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA 2 μl，加dd H2O補(bǔ)至50 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)有無陽性擴(kuò)增產(chǎn)物及目的基因片段長度進(jìn)行判斷分析。

1.2.3 生物膜檢測及判讀 根據(jù)參考方法，對(duì)生物膜的形成進(jìn)行了檢測[4]。對(duì)在TSB培養(yǎng)基中過夜生長的細(xì)菌；稀釋200與TSBG培養(yǎng)基中，其中有0.5%的葡萄糖；每孔200ul加樣到96孔聚苯乙烯微板上，每個(gè)菌株3個(gè)復(fù)孔；37攝氏度的情況下靜態(tài)孵化24小時(shí)；吸干孔子菌液并用PBS清洗3次，用甲醇固定15分鐘后吸干，用0.5%的結(jié)晶紫染色10分鐘后吸干，再用蒸餾水沖洗；最后加入4：1無水乙醇和丙酮的匯合溶液，混合均勻后在OD570光度下檢測。每一項(xiàng)試驗(yàn)至少進(jìn)行三次。生物膜OD值的判讀在染色后的96個(gè)微孔讀數(shù)從0.05到3.5不等。生物膜表型分類基于他人的方法，強(qiáng)陽性（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和OD570＜1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件完成。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜的形成特點(diǎn)

在結(jié)晶紫染色后的96孔板讀數(shù)從0.04到3.5。生物膜表型分類基于他人的方法分為（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和＜1）[4-5]。OG1RF控制菌株（弱生物膜）和ATCC29212菌株OD570的中值分別為0.95和0.22。在所有被檢測的糞腸球菌分離菌株中，有超過一半的糞腸生物膜表現(xiàn)為弱陽性及以上，在這些生物膜形成的菌株中，弱生物膜表型、中等生物膜表型和強(qiáng)生物膜表型中菌株數(shù)相差不大。利用肉湯稀釋法測定了紅霉素的MIC值，并對(duì)MIC 8 μg/mL的抗性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)192株含有紅霉素抗性的菌株；紅霉素敏感、中介和耐藥的糞腸球菌生物膜形成的流行率為71.4%（5/7）、51.9%（27/52）和58.9%（113/192）（見表1）。值得注意的是強(qiáng)生物膜形成比例在紅霉素耐藥和中介菌株中高于紅霉素敏感組（19.8% vs.13.5%vs.0），中介組和耐藥組強(qiáng)生物膜形成比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成與紅霉素耐藥基因之間的聯(lián)系

PCR檢測結(jié)果提示紅霉素耐藥糞腸球菌的耐藥基因ermA、ermB和ermC陽性檢出率分別為1/192、155/192和1/192；ermA和ermC各自檢測到一株陽性株，生物膜分別為強(qiáng)陽性和陽性，但陽性基因菌株數(shù)量太少，ermA和ermC耐藥基因與生物膜形成之間關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。ermB基因與生物膜形成相關(guān)性經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著相關(guān)性（P＞0.05）（見表2）。

2.3 生物膜形成與毒力基因間的相關(guān)性

表3所示，192株糞腸球菌紅霉素耐藥的菌株，對(duì)PCR擴(kuò)增毒性基因的分析表明，esp、asal 和cylA陽性糞腸球菌分離菌株比其相對(duì)應(yīng)的陰性分離株的生物膜形成率顯著提高。此外，生物膜的形成與esp和cylA毒力基因有關(guān)。

3 討論

本研究結(jié)果提示糞腸球菌生物膜形成陽性率為57.8%，低于歐洲先前報(bào)道的60%～90%的流行率[5-8]。特別是在這項(xiàng)研究中，從膽汁中分離出來的糞腸球菌生物膜的流行率為36.4%，比由尿液和血液分離出來的生物膜陽性率低了超過20.0%，我們的生物膜陽性率與其他地區(qū)報(bào)道的不一致可能與地區(qū)差異有關(guān)。本研究結(jié)果提示紅霉素耐藥糞腸球菌的陽性率（58.9%）與紅霉素中介組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高于紅霉素敏感組，可能與紅霉素敏感菌株入組例數(shù)太少有關(guān)，紅霉素敏感組的糞腸球菌生物膜形成比例有待進(jìn)一步研究。總體而言，紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜陽性在糞腸球菌中并沒有顯著偏高，但強(qiáng)陽性的菌株在紅霉素耐藥組和中介組比例高于敏感組需要引起注意。

糞腸球菌生物膜形成和抗生素耐藥關(guān)系的研究報(bào)道較多。近年報(bào)道提示利奈唑胺耐藥株生物膜形成比例顯著升高，耐藥株中強(qiáng)生物膜形成菌株顯著高于利奈唑胺敏感菌株組。紅霉素耐藥基因的檢測中發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌主要攜帶ermB基因，ermA、 ermB和ermC基因與生物膜的形成沒有相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)紅霉素耐藥糞腸球菌中esp+分離株更有可能表現(xiàn)出強(qiáng)或中等的生物膜形成，這與之前的幾項(xiàng)研究一致，這些研究表明該毒力基因和糞腸球菌生物膜形成之間聯(lián)系[9-10]。本研究提示hyl基因和gelE基因與糞腸球強(qiáng)或中生物膜形成成反比；這與先前的研究結(jié)果，能夠水解明膠、膠原蛋白和血紅蛋白的gelE可能有利于糞腸球菌生物膜的發(fā)展不一樣；但也有另一些研究則發(fā)現(xiàn)，在糞腸球菌中，gelE的存在與生物膜的形成沒有顯著的相關(guān)性。此為本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了cylA與糞腸球菌生物膜的形成成正比；此前有報(bào)道稱，CylA與尿道分離的糞腸球菌生物膜形成有關(guān)。因此紅霉素耐藥糞腸球菌中CylA基因和Esp基因與生物膜形成密切相關(guān)[11-13]。

表1 紅霉素敏感性與生物膜形成之間的關(guān)系分析

表2 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成與耐藥基因之間的關(guān)系

表3 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成與毒力基因之間關(guān)系

總之，目前的研究表明紅霉素耐藥糞腸球菌容易形成生物膜，耐藥組生物膜形成陽性率與紅霉素中介組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成能力與ermB基因無顯著相關(guān)性。esp、gelE和cylA與紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成顯著性相關(guān)。