一株生物表面活性劑產生菌的篩選及培養條件優化

王佳楠

摘要：采集室內觀賞植物巴西木葉片，經過富集培養、血平板篩選、發酵液排油能力測定和發酵液表面張力測定等，篩選出具有產生物表面活性劑能力的菌株J3-21。對其培養條件進行，確定氯化銨和蔗糖為氮源和碳源時，在28℃條件下，再補充部分酵母粉，可以使發酵液表面張力可降低至25 mN/m。

關鍵詞：生物表面活性劑；表面張力；培養條件優化

生物表面活性劑（biosurfactant）是由微生物產生的具有高表面活性的生物分子，是集親水基和疏水基結構于一身的兩親化合物[1，2]。相對于化學合成的表面活性劑，生物表面活性劑對生態系統的毒性較低，且可生物降解。因此，生物表面活性劑的特性決定了其在醫藥、石油工業、化妝品、洗滌劑、環境工程和食品工業等領域的廣泛應用[2]。植物葉片表面因為存在蠟質等植物保護性物質，是篩選產生表面活性物質的微生物的重要環境之一。

1.材料與方法

1.1植物樣品

室內景觀植物巴西木葉片。

1.2儀器與試劑

LDZX-40BI型立式電熱壓力蒸汽滅菌器、ZD-85恒溫振蕩器、FA1104電子天平、SW-CJ2FD潔凈工作臺、LRH-280生化培養箱、JK99C全自動表面張力儀。試劑均為分析純。

1.3方法

1）菌株富集與分離。稱取樣品10g，加入90ml無菌水，150r/min搖床振蕩1h，取上清液10ml接種到100ml已滅菌的富集培養集中，于37℃、150r/min的恒溫搖床上振蕩培養3d。在同樣條件下進行二次培養。取二次富集培養的培養液1mL，用無菌水進行梯度稀釋（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度）。巴西木葉片，置于富集培養基中，經過15天富集后，將富集液體涂布于血平板培養基上，挑去能夠產生溶血圈的菌株，作為備選菌株。

2）菌株的篩選。將純菌株接種到50ml發酵培養基中，于28℃、150 r/min條件下培養72h。取100μl發酵液接種到已滅菌的100ml發酵培養基中，于37℃、150r/min培養3d。取直徑20cm培養皿，經過二次酸洗后加二次蒸餾水30ml，滴加8ml液體石蠟，等待20-30min，形成穩定油膜后加入100μl發酵液于油膜中心，測定排油圈直徑。

3）發酵培養。將純菌株接種到50ml發酵培養基中，于28℃、150r/min條件下培養72h。

4）單因素培養條件優化。以發酵培養基為基礎，對碳源、氮源的種類及培養溫度進行單因素試驗，確定C源、N源的種類及培養溫度。

5）正交實驗設計。以碳源、氮源、酵母粉和培養時間為影響因素，以各因素添加量和時間為不同水平，以表面張力下降情況和菌濃作為考察指標，設計四因素三水平正交試驗，如下表1：

6）菌種鑒定 對篩選所得的菌株進行革蘭氏染色、芽孢染色及生理生化試驗鑒定，確定細菌的種屬。

2.結果與討論

2.1產表面活性劑菌株的分離篩選結果

對巴西木葉片中的微生物種群中表面活性物質產生菌株進行富集培養，再經過血平板分離，共獲得21株備選細菌菌株，對各菌株進一步考察，測定發酵液的排油能力，得到備選產表面活性劑的菌株4株，測量到這些菌株的排油圈直徑，大于4cm，說明這些菌株的代謝產物有較好的排油性能，而效果最好的一株菌編號為J3-21，排油圈直徑達6.5cm。

2.2菌株培養基條件的優化

1）碳源的選擇。分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉、草酸、可溶性淀粉為碳源，在28℃，初始pH值為7.0～7.2，150r/min條件下恒溫振蕩培養72h，分別測定發酵液的排油能力。

由圖1a可知，蔗糖為碳源時菌株J3-21發酵液的排油活性最好，表面張力降低至27.2mN/m（注：20攝氏度條件下，空白培養基的表面張力為65.7mN/m），因此，選擇蔗糖為最佳碳源。

2）氮源的選擇。分別以硝酸鈉、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、牛肉膏這 5種氮源，以蔗糖為碳源，初始pH值為7.0～7.2，28℃、150r/min條件下恒溫振蕩培養3d后，測定發酵液的排油活性。

由圖1b可知，氯化銨為碳源時菌株J3-21發酵液的表面張力降低至25.2mN/m（注：20攝氏度條件下，空白培養基的表面張力為65.7mN/m），因此，選擇氯化銨為最佳氮源。

3）培養溫度的選擇。以蔗糖為碳源，氯化銨為氮源，初始pH值為 7.0～7.2，分別于24、28、32、36℃，150r/min條件下恒溫振蕩培養3天，測定發酵液的排油活性。當培養溫度為28℃時，

由圖1c可知，培養溫度為28℃時菌株J3-21發酵液的表面張力降低至25.2mN/m（注：20攝氏度條件下，空白培養基的表面張力為65.7 mN/m），因此，選擇28℃為較優良的培養溫度。

2.3 菌種鑒定

對菌株J3-21進行了革蘭氏染色、芽孢染色。在油鏡下觀察，該菌株呈細長桿狀；革蘭氏染色后，菌體為紫色；經孔雀綠-番紅染色后，可觀察到紅色的菌體和綠色的芽孢區，芽孢較小。J3-21的生理生化反應結果見表2：

3.結論

綜合以上結果，培養基中，氮源和酵母粉添加量會對J3-21發酵液中菌濃和表面活性物質產生較大影響，生物表面活性物質產量與菌濃存在一定的負相關，可能表活物質對菌株具有一定的抑制作用，次級代謝產物的積累不利于菌體的生長。因此，后期實驗中準備通過培養中進行補料的形式，在較高菌濃情況下對培養基進行補料以產生更多的表面活性物質。

參考文獻：

[1]張卉，郝國良，徐俊斌.生物表面活性劑產生菌的篩選及培養條件優化[J].沈陽師范大學學報（自然科學版），2012，04：477-485

[2]盧國滿.產表面活性劑菌株的篩選、發酵條件優化及定量研究[D].湖南大學，環境科學專業，2006年