超聲波-微波酶解提取河蚌肉蛋白工藝優化

許雅寧，李江飛，孫 琦，鄒 東，詹春怡，周亞軍

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林長春 130012）

河蚌是軟體動物蚌科一類的總稱，在我國分布廣泛、價格低廉，但該資源并未得到充分利用[1-2]，少部分用作食材，多數作為廢棄物直接丟棄。河蚌肉具有高蛋白、低脂肪的特點，含有礦物質、人體必需氨基酸和微量元素等[3]，對人體具有良好保健功效[4]。通過Caglak A E等人[5]的研究發現，河蚌肉與傳統肉類相比熱量更低、脂肪含量更低、所含礦物質更多，所以是很好的蛋白粉制取原料。

人們對河蚌蛋白粉提取工藝有著很長時間的摸索，張艷萍等人[6]用堿法提取了貽貝中的蛋白質并且除去了其中的蛋白多糖，賀琴[7]通過高壓脈沖電場對河蚌蛋白進行了提取，但這些傳統方法，均存在著對原料有所損傷、耗能較高、技術復雜等缺陷。近年來，因為有著環境友好、反應條件溫和的優點[8]，酶解法越來越多地被人們應用于食品工業中，但基本上都是利用單一酶進行研究。閆永等人[9]利用木瓜蛋白酶進行河蚌肉酶解軟化工藝的探討。徐兆剛等人[10]選用中性蛋白酶利用響應面法進行河蚌酶解工藝的優化并制備河蚌蛋白抗氧化肽。宋亮等人[11]采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶等進行河蚌酶解最優條件的探索。

但是，酶解的反應速率緩慢，大大限制了該項工藝在實際生產中的應用。增加酶促反應速率的方法有很多種，比如固定化[12]、化學修飾法[13]，近年來，超聲輻照和微波催化廣泛用于加快反應速率，其中已經成功應用于生產醇類[14]和生物柴油[15]。

試驗以河蚌肉為原料，采用超聲波-微波酶解（木瓜蛋白酶等）提取蛋白，并優化酶解工藝，為高營養價值河蚌肉蛋白粉的研制和開發提供理論依據和借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松花江野生被角無齒蚌，購于長春市扶余市長春嶺鎮；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶，南京奧多福尼生物科技有限公司提供；氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設備

SZ-22型打漿機，廣州旭眾食品器械有限公司產品；JJ200型電子天平，常熟市雙杰測試儀器場產品；PHSJ-4A型試驗pH計，上海禹昂自動化科技有限公司產品；THZ-98A型恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司產品；SHJ-4B型恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州高德儀器制造有限公司產品；TGL-16gR型高速臺式冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠產品；MAS-II型微波反應儀，上海新儀微波化學科技有限公司產品；SP-756P型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品；FD-1C-80型冷凍干燥機，北京博醫實驗儀器有限公司產品等。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理

河蚌用清水養2～3 d，去除外殼、蚌淚和內臟組織之后洗凈、淋干，用膠體磨絞碎，在-18℃條件下冷凍備用，作為待試樣品。

1.3.2 河蚌肉基本組分分析

測定原料的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分。詳見1.4.3。

1.3.3 最佳蛋白酶的篩選

參照GB/T 23527—2009中的方法測定所用酶的酶活力。各取5 g樣品，在每種酶的最適溫度、最適pH值下，酶添加量為4 000 U/g，料液比為1∶12，恒溫振蕩（150 r/min） 酶解4 h，結束后迅速水浴滅酶 （90℃，10 min），離心 （4 000 r/min，10 min） 取上清液，加入雙縮脲試劑，30 min后采用紫外可見分光光度計于波長540 nm處測定吸光度。計算蛋白提取率。從經濟和酶解效果等多方面考慮，篩選出最適宜的酶解用酶。

不同蛋白酶的最適反應條件見表1。

表1 不同蛋白酶的最適反應條件

1.3.4 酶解提取河蚌蛋白

以酶添加量、pH值、酶解溫度、料液比、酶解時間研究其對蛋白提取率影響的變化規律。取5 g樣品，酶添加量4 000 U/g，料液比1∶12，在酶解溫度55℃，酶解pH值6.5的條件下酶解4 h，結束后迅速水浴滅酶（90℃，10 min），離心（4 000 r/min，10 min） 取上清液，加入雙縮脲試劑，30 min后采用紫外可見分光光度計于波長540 nm處測定吸光度；計算蛋白提取率，固定其他條件，分別探討不同酶添加量、料液比、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間對河蚌蛋白提取率的影響。

酶解提取河蚌蛋白單因素與水平設計見表2。

表2 酶解提取河蚌蛋白單因素與水平設計

根據單因素試驗結果選取適宜條件，以酶添加量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間為因素進行四因素三水平響應面優化試驗。

1.3.5 超聲波-微波酶解

取10 g樣品，以優化得到的條件配制原料液，均質2 min，于超聲波-微波復合反應儀下用不同微波功率、微波時間處理，根據單因素試驗結果選取適宜條件，增加酶添加量為變量進行L9（34）正交試驗。酶解操作同1.3.4。

超聲波-微波酶解提取河蚌蛋白單因素與水平設計見表3。

1.4 分析方法

1.4.1 蛋白質量濃度及標準曲線的測定

酶解液離心后取上清液1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，空白調零，30 min后采用紫外可見分光光度計于波長540 nm處測定吸光度。根據牛血清白蛋白標準曲線（Y=0.044 8X+0.006，R2=0.998 3）計算對應的蛋白質量濃度。

1.4.2 蛋白提取率的計算

式中：C——測得的可溶性蛋白質量濃度，mg/mL；

A——稀釋倍數；

V——蛋白提取液體積，mL；

m——河蚌肉的質量，g；

w——河蚌蛋白含量，g/g。

1.4.3 河蚌肉基本營養成分測定

水分，采用直接干燥法測定[17]。；粗蛋白，采用凱氏定氮法測定[18]；粗脂肪，采用索氏抽提法測定[19]；灰分，采用坩鍋法測定總灰分[20]。

2 結果與分析

2.1 河蚌肉基本組分分析

河蚌肉基本組分分析見表4。

表4 河蚌肉基本組分分析/%

從表4中可以看出，河蚌肉確實是一種高蛋白、低脂肪的優質蛋白質，其中粗蛋白含量為7.51%左右，約為河蚌肉干料成分的53.26%，與張緩等人[16]測出的51.07%相近，因此河蚌肉是優質的蛋白酶解原料。

2.2 最佳蛋白酶的篩選

不同蛋白酶的酶活力值和對河蚌肉蛋白的提取率見表5。

表5 不同蛋白酶的酶活力值和對河蚌肉蛋白的提取率

不同的蛋白酶具有不同的反應活力，所以合適的蛋白酶對于河蚌蛋白的提取有著重要影響。由表5可知，其中就酶活力而言，木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞風味蛋白酶＞中性蛋白酶＞菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶酶活力與其他4種酶相差較大；就酶解效果而言，蛋白提取率中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞風味蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的蛋白提取效果最好，但是中性蛋白酶的酶解液呈灰褐色，木瓜蛋白酶酶解液呈淺黃色，感官品質較好，綜合考慮各種蛋白酶的酶活力值和酶解效果，選擇木瓜蛋白酶進行酶解試驗，與賀琴、郭福軍等人[7，17]的試驗用酶一致。

2.3 酶解提取河蚌蛋白

2.3.1 酶解pH值對蛋白提取率的影響

酶解pH值對蛋白提取率的影響見圖1。

在其他條件相同的條件下，由圖1可知，酶解pH值6.5時，酶解河蚌肉的蛋白提取率達到最大值；酶解pH值大于或小于6.5，蛋白提取率出現下降趨勢。因此，可得出木瓜蛋白酶的最適酶解pH值6.5。

圖1 酶解pH值對蛋白提取率的影響

2.3.2 酶解時間對蛋白提取率的影響

酶解時間對蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 酶解時間對蛋白提取率的影響

由圖2可得知，隨著酶解時間延長，蛋白提取率呈上升趨勢，在酶解時間為4 h處蛋白提取率出現峰值，未到4 h時酶解不充分，超過4 h后可能有蛋白質水解。因此，最佳酶解時間為4 h。

2.3.3 酶解溫度對蛋白提取率的影響

酶解溫度對蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對蛋白提取率的影響

除了酶解pH值以外，酶解溫度對于酶的提取效率也有著重要的影響。由圖3可知，酶解溫度小于50℃時，蛋白提取率逐漸增加；在酶解溫度50℃處，蛋白提取率出現峰值；超過50℃后，蛋白提取率出現下降趨勢，推測可能是溫度導致酶失活所致。因此，選取木瓜蛋白酶最適酶解溫度為50℃。

2.3.4 酶添加量對蛋白提取率的影響

酶添加量對蛋白提取率的影響見圖4。

從圖4可知，酶添加量小于3 000 U/g時，蛋白提取率迅速增加；在3 000 U/g處有最大值；超過3 000 U/g后呈下降趨勢。因此，最佳酶添加量為3 000 U/g。

2.3.5 料液比對蛋白提取率的影響

圖4 酶添加量對蛋白提取率的影響

料液比對蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 料液比對蛋白提取率的影響

圖6 酶添加量和酶解時間的交互作用圖及等高線

由圖5可知，料液比小于1∶9時，蛋白提取率隨液體比例增加而增大，蛋白水溶水解更充分；在1∶9時，達到峰值；超過1∶9后，蛋白提取率呈下滑趨勢但變化較小。因此，最佳料液比為1∶9。

2.3.6 響應面法優化酶解提取河蚌肉蛋白

酶解響應面優化試驗因素與水平設計見表6，酶添加量和酶解時間的交互作用圖及等高線見圖6，酶解溫度和酶添加量的交互作用圖及等高線見圖7，酶解溫度和酶解時間的交互作用圖及等高線見圖8，酶解溫度和酶解pH值的交互作用圖及等高線見圖9，酶添加量和酶解pH值的交互作用圖及等高線見圖10，酶解pH值和酶解時間的交互作用圖及等高線見圖11，酶解響應面優化試驗設計及結果見表7。

表6 酶解響應面優化試驗因素與水平設計

圖7 酶解溫度和酶添加量的交互作用圖及等高線

圖8 酶解溫度和酶解時間的交互作用圖及等高線

圖9 酶解溫度和酶解pH值的交互作用圖及等高線

利用Design Expert 8.0.6軟件對所得數據進行回歸分析，得到回歸方程為：

蛋白提取率回歸模型的方差分析見表8。

由表8可知，回歸模型顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p=0.063 9＞0.05），R2=0.840 4表明此模型能解釋84.04%響應變化，回歸方程擬合度較好，說明此模型能較好地擬合和預測實際情況。通過比較回歸方程的系數可以比較因素影響的顯著性[18]。由回歸方程可知，河蚌肉的酶解過程中，對蛋白提取率的影響程度為酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量。

經響應面優化試驗分析得出，木瓜蛋白酶酶解河蚌肉的最優條件為酶解時間4.35 h，酶解溫度48.22℃，酶添加量3 729.07 U/g，酶解pH值6.70，與徐兆剛等人[10]的優化結果相近，在此條件下預測的蛋白提取率為70.297 3%。為了檢驗模型預測的可靠性，取最佳酶解條件為酶解時間4.4 h，酶解溫度48℃，酶添加量3 729 U/g，酶解pH值6.7，進行3次驗證試驗，測得的蛋白提取率為71.42%，與預測值接近，表明預測值擬合性較好。因此，經響應面法優化得到的工藝參數較可靠，具有實用性。

圖10 酶添加量和酶解pH值的交互作用圖及等高線

表7 酶解響應面優化試驗設計及結果

2.4 超聲波-微波酶解

2.4.1 超聲波-微波處理對河蚌肉蛋白提取率的影響

圖11 酶解p H值和酶解時間的交互作用圖及等高線

表8 蛋白提取率回歸模型的方差分析

超聲波-微波處理對河蚌肉蛋白提取率的影響見圖12。

圖12 超聲波-微波處理對河蚌肉蛋白提取率的影響

超聲波-微波處理可以有效提高蛋白質的酶解效率[19]，在其他條件相同時，由圖12可知，超聲波-微波處理與未處理的樣品相比較，在不同的酶解時間，蛋白提取率均有不同程度提高。經超聲波-微波處理的樣品在酶解2 h時，蛋白提取率已經高于未經超聲波-微波處理酶解4 h的樣品，可見超聲波-微波處理不僅能提高蛋白提取率，還大幅縮短了所需酶解時間。

2.4.2 微波功率對河蚌肉蛋白提取率的影響

微波功率對河蚌肉蛋白提取率的影響見圖13。

圖13 微波功率對河蚌肉蛋白提取率的影響

微波可以有效提供能量讓蛋白質酶解效率上升，蛋白質分解更徹底，但是微波的功率過高可能導致酶或者蛋白的結構遭到破壞，卞蓉霞[20]研究表明，在微波體系中木瓜蛋白酶最為穩定，所受微波影響比其他蛋白酶更小。可見找到一個合適的微波功率對于蛋白質的提取有著重要的影響。由圖13可知，微波功率為300 W時，河蚌肉酶解的蛋白提取率最高；超過300 W后，隨著微波功率增加，蛋白提取率出現下降趨勢。可能是因為過高的微波功率使河蚌肉蛋白或木瓜蛋白酶受熱受到破壞。因此，最佳微波功率為300 W。

2.4.3 超聲波-微波處理時間對河蚌肉蛋白提取率的影響

超聲波-微波處理時間對河蚌肉蛋白提取率的影響見圖14。

圖14 超聲波-微波處理時間對河蚌肉蛋白提取率的影響

由圖14可知，超聲波-微波處理時間為4 min時蛋白提取率最高，超過4 min后隨著微波處理時間加長蛋白提取率下降。可能是因為超聲波-微波處理時間過長使河蚌蛋白和木瓜蛋白酶結構受到破壞。因此，最佳超聲波-微波處理時間為4 min。

2.4.4 正交優化超聲波-微波酶解

超聲波-微波酶解正交試驗因素與水平設計見表9，超聲波-微波酶解正交試驗結果見表10。

按照極差大小分析出對河蚌蛋白提取率影響的主次順序為C＞A＞B，即處理時間＞酶添加量＞微波功率。正交試驗確定的最佳處理條件為A3B3C2，即酶添加量4 000 U/g，微波功率400 W，微波處理時間3 min。在最佳工藝參數的條件下進行3次驗證試驗，所得蛋白提取率為87.25%。因此，正交優化試驗結果可靠，具有可行性。經超聲波-微波處理后的蛋白提取率比未經處理的高出22%，可見超聲波-微波處理不僅加速了酶解，還使酶解程度更加徹底，蛋白利用率更高，這與郝立靜[21]的研究結論一致。

表9 超聲波-微波酶解正交試驗因素與水平設計

表10 超聲波-微波酶解正交試驗結果

3 結論

（1）通過單因素試驗和響應面優化試驗得出木瓜蛋白酶酶解河蚌肉最優參數為料液比1∶9，酶解時間4.35 h，酶解溫度48.22℃，酶添加量3 729.07 U/g，酶解pH值6.70。在此條件下，經驗證試驗，蛋白提取率達到71.42%，與預測值基本吻合。

（2）經單因素試驗和L9（34）正交優化得到超聲波-微波酶解河蚌肉的最優參數為微波功率400 W，微波處理時間3 min。在此條件下，蛋白提取率達到87.25%，是未經超聲波-微波處理的蛋白提取率的1.22倍。為進一步制備河蚌肉蛋白粉奠定基礎。