添加辣椒對酸魚發酵進程和理化指標的影響

夏秀東,單成俊,劉小莉,吳 寒,王 英,張麗霞,黃自蘇,周劍忠

(江蘇省農業科學院 農產品加工研究所,江蘇 南京 210014)

有著千年歷史的酸魚是在淡水魚中加入較低量的食鹽和一定量的香辛料辣椒后經密閉自然發酵而成的傳統發酵制品[1]。酸魚不僅酸香濃郁、風味獨特、回味醇厚、貯藏期長,而且營養豐富，蛋白含量高，富含多種游離氨基酸,而脂肪含量低，因此深受人們的青睞，在我國、日本及東南亞等地具有很大的需求市場[2]。自然發酵微生物對發酵產品的感官和營養特性以及安全性起著重要的作用[3]。因此,發酵食品中微生物菌落的演替過程及其對發酵產品質量及安全的影響也成為當前的研究熱點[4]。據2015年聯合國糧農組織(FAO)的調查結果，全球每年對辣椒的消費量達到350萬t,辣椒是世界上消費量最大的調味品之一[5]。辣椒具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎、抗糖尿病、減肥、治療胃病等作用，因此它被廣泛用于食品保鮮和醫療保健領域[5]。辣椒占酸魚產品總重量的1%～2%[6]；辣椒的添加在賦予酸魚獨特的香辛味的同時也會影響酸魚發酵過程中微生物群落的演替和代謝途徑的變化,進而影響酸魚產品的風味和品質，但其具體作用機制尚不清楚。

在高通量測序技術普及之前,傳統的微生物分離培養技術和主要基于rRNA測序的PCR-DGGE技術在探索傳統發酵食品中微生物群落演替中發揮了重要的作用。隨著高通量測序技術的廣泛應用,人們發現這些技術存在著獲取信息不全面、重復性差和靈敏度低等缺陷[7]。而基于高通量測序的宏基因組學分析技術則克服了這些缺陷。借由宏基因組測序技術,大量不可培養的微生物得以被發現，新的功能基因或新基因簇得以被認知,這極大地促進了對微生物群落組成、演替及其互作的認識,可以對群落中微生物的代謝特征和代謝途徑進行預測。本研究利用生化分析方法和高通量測序技術分析了辣椒在酸魚發酵過程中對pH值、揮發性鹽基氮(TVBN)和細菌演替過程的影響,以期為深入研究辣椒對發酵酸魚風味和品質的影響提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

草魚購自江蘇省南京市玄武區孝陵衛菜市場。

PCA (plate count agar)瓊脂培養基(上海盛思生化科技有限公司); QIAGEN DNA Mini-Kit (QIAGEN, Hilden, Germany); Illumina Hiseq測序平臺(Illumina公司); HJ-3型數顯恒溫磁力攪拌器(國華電器有限公司); SX-500-TOMy高壓滅菌鍋(日本Tomy公司); SIGMA 3K15離心機(美國Sigma公司); THZ-C-1型臺式全溫振蕩器(蘇州培英實驗設備有限公司); CRh-150生化培養箱(上海一恒科技有限公司); Sw-CJ-K型雙人單面凈化工作臺(蘇州華宏凈化技術有限公司); JT-B均質器(河南兄弟儀器設備有限公司);便攜式pH計(美國Thermo公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸魚的制作和取樣 參照Zeng等[8]的實驗方法,取新鮮草魚,去鱗除內臟,用清水洗凈后將其分割成長度5 cm左右的魚塊,按照草魚75%、食鹽3%、蔗糖2%、辣椒粉2%(不加辣椒粉的酸魚作為對照)、茴香0.2%、肉桂0.1%、花椒0.2%的比例添加食鹽和各種香辛料,混合均勻后置冰箱中腌制24 h,曬制2 d以除去部分水分；然后加入17.5%的炒制玉米粉,并在魚肚中塞入部分炒制玉米粉,在陶瓷壇的底部鋪上部分炒制玉米粉作為底料；按魚層鋪輔料,壓緊,在頂部鋪上一層輔料后再鋪上一層塑料,加蓋封嚴,自然發酵50 d。分別在發酵第0、3、5、10、15、20、25、30、40、50天取酸魚樣品進行分析。

1.2.2 平板計數及細菌分離 參照夏秀東等[9]的實驗方法,稱取酸魚樣品25 g放于滅菌勻漿杯中,加入225 mL 0.85%無菌生理鹽水,充分研磨后轉移到滅菌的500 mL三角瓶中,以200 r/min振搖30 min,靜置15 min,自然沉淀；用0.85%生理鹽水對上清液進行10倍梯度稀釋；取0.1 mL的稀釋液均勻涂抹在PCA培養基上,培養1～2 d,記錄菌落總數,每個樣品做3個平行實驗。

1.2.3 TVBN值的測定 具體方法參照SC/T 3032—2007水產品中揮發性鹽基氮的測定方法。

1.2.4 pH值的測定 準確稱取10 g樣品，用剪刀剪成小塊后放入均質機中,加90 mL去離子水,用均質機充分均質30 s，然后在室溫下放置30 min,用數顯pH計測量pH值。

1.2.5 酸魚樣品中總DNA的提取和宏基因組分析 參照Hong等[10]的實驗方法,取10 g酸魚樣品，加入90 mL生理鹽水(0.85% NaCl)中，于高速勻漿機中勻漿1 min,然后用干凈的紗布過濾樣品,濾掉較大的魚肉組織。用QIAGEN DNA Mini-Kit提取樣品的宏基因組DNA。宏基因組DNA經檢驗合格后片段化構建PE文庫,利用Illumina Hiseq測序平臺對樣品的基因組進行測序,得到原始數據。

對原始數據進行質量控制之后,用Usearch軟件對數據進行去嵌合體和聚類的操作。在進行Usearch聚類時,先將read按照豐度從大到小排序,通過97%相似度的標準聚類,得到OTU (Operational Taxonomic Unit),每個OTU被認為可代表1個物種。在聚類過程中利用Denovo方法去除嵌合體(chimeras)。接下來對每個樣品的tags進行隨機抽平處理,并提取對應的OTU序列。然后使用Qiime軟件,做alpha多樣性指數的稀釋曲線,根據稀釋曲線選擇合理的抽平參數；利用Qiime軟件對得到的抽平后的OTU進行分析,首先從OTU中分別提取1條read作為代表序列,使用Uclust方法,將該代表序列與16S數據庫比對,從而對每個OTU進行物種分類。歸類后,根據每個OTU中序列的條數,得到OTU的豐度表,最后根據該OTU豐度表進行后續分析。

1.2.6 數據處理 用Origin 9.1對實驗數據作圖。通過Qiime軟件,采用迭代算法,分別在加權物種分類豐度信息和不加權物種分類豐度信息的情況下進行差異計算,得到最終的統計分析結果表并做出PCA展示圖。

2 結果與分析

2.1 酸魚發酵過程中微生物菌落總數和pH值的變化情況

發酵酸魚樣品分為添加辣椒和不添加辣椒兩組。圖1A結果表明：添加辣椒組的菌落總數在發酵的前25 d內均低于未添加辣椒組；從第25天開始添加辣椒組的微生物菌落總數與未添加辣椒組無顯著差異。圖1B結果表明：添加辣椒組的pH值在發酵的前30 d內均低于未添加辣椒組；從第25天開始添加辣椒組的pH值與未添加辣椒組無顯著差異。以上結果說明：在發酵前期,酸魚中添加辣椒可能抑制了其中一些微生物的生長,同時影響了酸性物質的產生；而到了發酵中后期,一些能夠耐受辣椒抑菌物質的微生物迅速生長,使得添加辣椒的酸魚的微生物總數迅速增加,同時產生大量的酸性物質，從而降低了酸魚的pH值。

圖1 酸魚發酵過程中菌落總數和pH值的變化

2.2 添加辣椒對揮發性鹽基氮(TVBN)產生的影響

TVBN是微生物分解蛋白質、氨基酸等含氮化合物產生的氨、生物胺等堿性代謝產物的總稱,是評價食品品質最常用的指標之一。由圖2可知,添加辣椒組的TVBN含量在酸魚發酵過程中一直低于未添加辣椒組的。這可能是由于添加辣椒抑制了一些產TVBN腐敗菌的生長。這說明,添加辣椒不僅可使傳統發酵酸魚擁有香辛味和保健功能,而且還能提高發酵酸魚產品的安全性和質量。

圖2 酸魚發酵過程中揮發性鹽基氮的變化情況

2.3 添加辣椒對酸魚發酵過程中細菌演替過程的影響

表1中的OTUs和Chao1數據顯示,添加辣椒會增加酸魚的細菌多樣性。在發酵前期,酸魚中的微生物多樣性都呈現快速下降的趨勢,這是由酸魚攜帶細菌間競爭性抑制和一些細菌不能適應因氧氣耗竭而形成的微氧環境造成的。但是,添加辣椒的酸魚的細菌多樣性下降較未添加辣椒的酸魚慢。在發酵中后期酸魚中的細菌多樣性基本穩定。值得注意的是,到了發酵后期,添加辣椒的酸魚的細菌多樣性低于未添加辣椒的酸魚的,這可能是由辣椒中的抑菌物質引起的。

圖3結果表明,在酸魚發酵過程中葡萄球菌(Staphylococcus)、乳桿菌(Lactobacillus)和魏斯氏菌(Weissella)逐漸成為優勢菌群,但是添加辣椒的酸魚中這3種細菌成為優勢菌群的時間晚于未添加辣椒的酸魚的,這一結果與表1結果一致。同時,值得注意的是魏斯氏菌在未添加辣椒的酸魚中數量較少,葡萄球菌和乳桿菌的數量較多,但在添加辣椒的酸魚中含有大量的魏斯氏菌,而葡萄球菌和乳桿菌的數量較少。

圖4主成分分析(PCA)結果顯示,在整個發酵過程中,兩種酸魚的細菌群落沿著相似的路線分配到PC1和PC2區域,這說明,在這兩種酸魚發酵過程中的細菌群落有著相似的演替過程。然而,添加辣椒的酸魚中細菌群落數據點在發酵前期移動較慢,說明辣椒減緩了酸魚的前期發酵過程。除了發酵初期外,葡萄球菌和乳桿菌是這兩種酸魚中均具有較大影響力的細菌。葡萄球菌是發酵前期影響力最大的細菌,其較強的蛋白酶活性可強力降解魚肉中的蛋白質,為其他微生物的生長提供充足的氮源。乳桿菌是發酵后期最有影響力的細菌。魏斯氏菌在未添加辣椒的酸魚中的影響力可以忽略,但是其影響力在添加辣椒的酸魚的發酵中期逐漸增加,同時葡萄球菌和乳桿菌在這一階段的影響力略微下降。這一結果也支持了添加辣椒會延長酸魚發酵前期的時間,同時使魏斯氏菌數量在酸魚發酵過程中持續增加而使葡萄球菌和乳桿菌數量相對減少的結論。

表1 發酵酸魚樣品細菌多樣性測序結果

A:未添加辣椒粉;B:添加辣椒粉。圖3 酸魚發酵過程中細菌豐度的變化情況

A:未添加辣椒粉;B:添加辣椒粉。圖4 酸魚發酵過程中細菌群落主成分分析結果

3 討論

傳統食品發酵體系是由多種微生物構成的獨特微生態環境,其中的微生物被稱為發酵食品的“靈魂”,與發酵制品的品質和風味形成有直接關系[11-12]。這些食物中的微生物群落多樣性和從中分離益生菌成為現在的研究熱點[4]。

辣椒居世界五大辛辣調味品之首,食辣范圍涉及世界60%的國家,食辣人口超過30億[13]。辣椒中含有豐富的維生素C、抗壞血酸、胡蘿卜素、辣椒紅素、酚類、辣椒素、肉桂酸等物質,使辣椒不僅具有獨特的香氣、辛辣味,而且具有抗菌和防腐的作用[5]。多項研究表明辣椒具有廣譜的抑菌效果,對蠟性芽孢桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌、腐敗菌以及酵母菌和霉菌均有一定的抑制效果[14-23]。這可能就是添加辣椒造成酸魚發酵前期菌落總數增加和pH值降低值減慢以及TVBN始終低于未添加辣椒的發酵酸魚的原因。

目前,國內外對辣椒在傳統發酵食品中對微生物演替及其代謝產物影響的研究非常少。Jeong和Ono等利用分析樣品總DNA中16S rRNA的方法[24-25]分別就辣椒在傳統發酵醬菜和發酵韓國泡菜生產過程中對微生物的演替及其代謝產物的影響進行了研究。Ono等發現添加辣椒可促進乳酸菌成為發酵醬菜的優勢細菌和乳酸的積累,尤其是戊糖片球菌和魏斯氏菌,進而抑制金黃色葡萄球菌和腐生葡萄球菌等主要致病菌的生長,大大縮短前乳酸發酵階段。Jeong等在發酵韓國泡菜中的研究結果與Ono等不同,他們發現添加辣椒會顯著延長發酵初期的時間；與未添加辣椒的泡菜相比,添加辣椒的泡菜在發酵初期菌落多樣性下降較慢,而在發酵的中后期菌落多樣性較低,且魏斯氏菌的相對數量顯著增加。這一結果與本研究的結果相似。

4 結論

添加辣椒可顯著影響酸魚的發酵進程,抑制發酵前期菌落總數的增加、pH值的降低和整個發酵過程中TVBN的生成,這可能是由于辣椒中的活性成分影響了酸魚發酵過程中細菌的演替過程。但是對于辣椒中的何種物質及其如何影響酸魚的發酵進程仍需做進一步的研究。