時間分辨免疫熒光層析快速檢測水產品中高效氯氰菊酯方法的建立

姜琳琳，蘇 捷

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

合成擬除蟲菊酯類農藥是有機磷和有機氯農藥的替代品，在全球范圍內占農藥使用量的30%以上[1]。氯氰菊酯(CYP)又是擬除蟲菊酯中應用最廣泛的農藥，有研究表明氯氰菊酯在水系統中的濃度約0.01～0.10 μg/L[2-3]。氯氰菊酯可以在水產品中富集[4]，干擾魚類的生殖周期，引起細胞膜過氧化指標升高，損傷神經細胞[5]。而如果人食用了富集氯氰菊酯的水產品，會引起免疫系統和神經系統的損傷[6-7]。因此對水產品中氯氰菊酯的監測是必要的。

目前針對氯氰菊酯的檢測主要有氣相色譜法(GC-ECD)、氣質聯用法(GC-MS)、液相-串聯質譜法(LC-MS/MS)、酶聯免疫法(ELISA)等技術方法[8-13]。這些檢測方法具有靈敏度高、結果穩定等優點，但是目前的檢測技術前處理復雜，耗時長，難以適應檢測任務量大的工作。時間分辨免疫熒光層析檢測技術(TRFICA)，是利用待測抗原與標記銪(Eu)顆粒的抗體結合后通過毛細管作用沿著硝酸纖維膜層析，與層析試紙上包被檢測抗原及質控二抗不同程度的結合，根據檢測線和質控線的熒光強度強弱及其比值，可以分析待測樣品中的抗原濃度。與常規檢測技術相比，時間分辨免疫熒光層析檢測方法省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟，具有操作簡單、適用于批量樣品的快速篩選檢測等優勢。

本研究通過Eu標記氯氰菊酯類農藥抗體，結合免疫層析技術，開發時間分辨免疫熒光層析快速檢測卡用于常用農藥高效氯氰菊酯的檢測，通過精確度、穩定性實驗，并與其它的檢測方法進行比對，為進一步開發應用時間分辨免疫熒光層析快速檢測卡檢測高效氯氰菊酯奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

熒光讀卡儀(上海杰一公司，JY1501FS)；旋渦混合器；冷凍離心機；噴金劃膜一體機(杰一，Bio-line)；氣相色譜儀(安捷倫6890N)；酶標儀(Tecan m 200)。

1.2 實驗材料

南美白對蝦采自廈門市場；高效氯氰菊酯(4.5%，廣東真格生物)；Eu標記試劑盒(DELFIA)；氯氰菊酯抗原和抗體由項目組研制。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗體的Eu標記

參考Eu標記試劑盒的標記方法對氯氰菊酯類農藥抗體進行標記。在包被有氯氰菊酯人工抗原的96孔板中分別加入稀釋倍數為100、200、400、800、1 600、3 200、6 400的標記抗體，37℃孵育2 h，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗6次，扣干，用酶標儀熒光模塊檢測熒光值，評價抗體的Eu標記效果，激發波長310 nm，發射波長610 nm，延遲時間300 μs。

1.3.2 氯氰菊酯免疫熒光層析檢測卡的制備[14]

將玻璃纖維用噴金平臺系統以15 μL/cm將Eu標記的氯氰菊酯類單克隆抗體噴在玻璃纖維上，37℃干燥2 h。用劃膜系統以1 μL/cm將氯氰菊酯類偶聯抗原(1 mg/mL)劃在硝酸纖維素膜上，即為檢測線； 在離檢測線4 mm處噴上羊抗鼠IgG(1 mg/mL)，即為質控線，37℃ 干燥2 h。取出一塊膠板，將噴有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜粘貼在中央區： 分別將吸水紙和膠金墊粘貼于硝酸纖維素膜的上方和下方，兩者之間重疊約2 mm；再在結合墊的上方粘貼玻璃纖維作為樣本墊，組裝成免疫熒光層析快速檢測卡，如圖1所示。

注：1-結合墊；2-檢測線T；3-質控線C；4-吸水墊；5-樣品墊；6-硝酸纖維素膜；7-載體墊；8-卡式外殼；9-點樣窗口；10-檢測窗口。

Notes：1- combination pad；2- detection line T；3- quality control line C；4- water absorbent pad；5- sample pad；6- nitrocellulose membrane；7- carrier pad；8- card shell；9-point window；10-detection window.

1.3.3 標準曲線制作

取南美白對蝦肌肉組織，用高速勻漿機絞成糜，置于磨口具塞試劑瓶中。試樣于-18℃以下冷凍保存備用。將上述制得的樣品于室溫下自然解凍(在具塞試劑瓶中)，準確稱取7份5 g絞碎的南美白對蝦肌肉組織陰性樣品于15 mL的離心管中，分別添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯標準品，加入正己烷-乙酸乙酯-丙酮(1∶2∶1，V/V/V)提取液15 mL后，漩渦震蕩儀上振蕩1 min，再超聲提取5 min(頻率 100 Hz)后2 000 r/min離心5 min。取上層有機相經裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾至雞心瓶。重復提取一次，合并提取液于40℃下旋轉蒸發至近干。取10 mL乙腈溶液溶解旋干物后轉移至新的離心管中，并用5 mL乙腈溶液洗滌雞心瓶，將洗液合并至離心管中。向上述乙腈溶解物中加入15 mL乙腈飽和的石油醚，振蕩1 min，使其充分混勻。混合液于4 000 r/min 離心7 min，棄去上層石油醚后取乙腈層，將其于 40℃下旋轉蒸發至近干。加0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解旋干物后，再溶解于0.9 mL PBS中，備用于檢測。分別取3滴添加到熒光檢測卡的樣品孔中，10 min后讀取熒光讀卡器中T線與C線的熒光響應值，以檢測線熒光值T與控制線熒光值C比值(T/C)為縱坐標(y)，以標準溶液濃度為橫坐標(x)，用ELISA Calc軟件進行四參數邏輯曲線擬合，獲得四參數擬合曲線和擬合方程y=f(x)。

1.3.4 樣品檢測

準確稱取5 g絞碎的南美白對蝦肌肉組織，參照標準曲線制作過程中的檢測方法提取高效氯氰菊酯，用PBS溶解后，滴加到檢測卡的樣品孔中，根據檢測線熒光值T與控制線熒光值C比值(T/C)和四參數擬合方程y=f(x)，可以計算出溶液中高效氯氰菊酯的濃度。

1.3.5 氣相色譜檢測方法

參考GB/T 5009.162—2008《動物性食品中有機氯農藥和擬除蟲菊酯農藥多組分殘留量的測定》標準對樣品進行檢測。

樣品前處理：稱取水產品肉樣5 g，選擇40 mL正己烷：丙酮(V/V，2∶1)混合溶液作為提取液，3 g中性氧化鋁作為凈化填料過柱凈化，用30 mL正己烷：丙酮(V/V，4∶1)混合溶液作為淋洗液，氮氣吹干，用正己烷定容，待上機。

氣相色譜條件：安捷倫6890N型氣相色譜儀(配有ECD檢測器)，HP-5(5%苯基甲基硅氧烷)毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。載氣為高純氮氣，流速1.0 mL/min；進樣口和檢測器的溫度分別為260℃ 、310℃ ；色譜柱升溫程序：初始溫度100℃，保持1 min，以10℃/min 升至285℃，保持5 min。恒流方式，不分流進樣，進樣量為1 μL。

2 結果

2.1 抗體的Eu標記結果

表1 Eu標記氯氰菊酯抗體的熒光檢測結果

對Eu標記的氯氰菊酯抗體(1 mg/mL)稀釋不同倍數后，通過與包被有氯氰菊酯抗原的96孔板孵育反應，檢測的的熒光值分析如表1所示，其中y=Fx/F100。由表1可以看出標記有Eu顆粒的菊酯抗體與96孔板上包被的抗原可以有效結合。對抗體稀釋倍數和熒光比值用ELISA Calc進行四參數擬合，擬合曲線方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D，其中A為1.11，B為 1.55，C為466.40，D為0.013，決定系數R2為0.995 0；擬合曲線如圖2所示。結果說明Eu標記氯氰菊酯抗體的濃度與待測組和對照組的熒光比值呈相關性，Eu標記氯氰菊酯抗體可以應用于競爭法檢測未知抗原的濃度。

2.2 氯氰菊酯熒光檢測卡的最低檢測限與檢測范圍

根據1.3.2的方法，制備氯氰菊酯熒光檢測試紙，如圖3A所示。圖3A中的3條試紙分別為未加樣、添加0 ng/mL和128 ng/mL的熒光檢測試紙，從圖中可以看出未加樣時，Eu標記的氯氰菊酯抗體在結合墊上，加樣品溶液時在吸水紙的作用下，通過毛細管作用沿著硝酸纖維素膜層析，當樣品中沒有氯氰菊酯(-)時，Eu標記的抗體與T線包被的人工抗原結合，T線熒值升高，C線熒光值降低；當樣品中有氯氰菊酯(+)時，Eu標記的抗體與C線包被的人工抗原結合，C線熒光值升高，T線熒光值降低。氯氰菊酯熒光檢測試紙按圖1的結構組合成檢測卡，以方便使用。參考1.3.3的方法在對蝦樣品中添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯標準品，經提取后定容至1 mL，獲得修正后的高效氯氰菊酯的標準溶液(文中所有的高效氯氰菊酯濃度都是以修正后的濃度計算)。取標準溶液3滴，滴加到檢測卡的加樣孔，用熒光讀卡器掃描并讀取熒光數值比值，如表2所示。對標準品濃度和熒光比值用ELISA Calc進行四參數擬合，擬合曲線方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D，其中A為8.81，B為1.35，C為3.02，D為0.19，R2為0.999 0；擬合曲線如圖3B所示。通過做基質加標標準曲線，可以減少基質復雜成份對檢測的影響，減少誤差。將獲得的A、B、C、D四參數輸入到熒光讀卡器中，就可以通過熒光讀卡器檢測樣品中高效氯氰菊酯的濃度。

表2 標準品濃度與T/C值

設y=f(x)，差值百分比計算如公式(1)和公式(2)所示。

公式(1)

公式(2)

F(x)的曲線圖如圖4A所示，由圖4A可以看出，隨著x值的增加，F(x)值逐漸減小，說明隨著x值的增加，f(x)變化減少，即熒光比值對樣品的濃度變化靈敏度下降，當x<19.3時，F(x)>5%；G(x)的曲線圖如圖4B所示，由圖4B可以看出，隨著x值的增加，G(x)值逐漸增加，說明隨著x值的增加，f(x)變化增加，即熒光比值對樣品的濃度變化靈敏度增加，當x>0.35時，G(x)>5%。

根據G(x)公式計算的最低檢測限計算結果，分別在10份蝦肉樣品中添加0.35 ng的高效氯氰菊酯，經提取后定容至1 mL，用熒光檢測卡檢測結果如表3所示。根據表3的結果可以看出當對蝦樣品中添加有0.35 ng高效氯氰菊酯時，可以被熒光讀卡器檢出，相對誤差在0.5%～68.6%之間。因此根據實驗結果該檢測卡的最低檢測限約為0.35 ng/mL。當濃度低于0.35 ng/mL時，樣品組的C/T值與空白組的更加接近，以致儀器有時無法檢測出具體數值。同理通過F(x)公式，可以計算出當樣品中待測物濃度差異為1 ng/mL時，C/T差異大于5%時，x的范圍即為檢測范圍。因此熒光檢測卡的檢測范圍是1～19.3 ng/mL。

表3 對蝦樣品中添加最低檢測限高效氯氰菊酯檢測結果

2.3 氯氰菊酯檢測卡準確度和精密度實驗

由于氯氰菊酯檢測卡批間生產和批內生產還存在生產上的誤差，為滿足檢測的要求，對生產的3批次檢測卡檢測的準確度和精密度進行驗證。通常可以用平均相對誤差(AARD)表示檢測結果的準確度，用變異系數(CV)表示檢測結果的精密度。以檢測范圍的最低值1 ng/mL的2倍和4倍進行驗證實驗，結果如表4所示，由表4可以看出三批檢測卡的平均相對誤差在4.24%～8.66%之間，回收率在89.1%～109.1%之間，平均回收率為98.9%，檢測卡批內變異系數在3.0%～8.6%之間，批間變異系數在4.8%～6.6%之間。

表4 對蝦中氯氰菊酯檢測卡檢測的準確度和精密度結果

以氣相色譜儀器的檢測結果為真值，則檢測結果相對誤差的計算如公式(3)所示，其中RE是代表相對誤差，R為氣相色譜儀器的檢測結果，R′是檢測卡檢測結果。

公式(3)

選用20個對蝦樣品，其中10個為陰性樣，檢測結果均為陰性；10個為隨機加標樣(1～4 μg/kg)，用檢測卡檢測結果與氣相色譜檢測結果(氣相色譜法檢測限為1 ng/mL)如表5所示。檢測卡檢測結果相對誤差在8%～20%之間。對兩種檢測結果的相關性分析如圖5所示，檢測卡檢測結果與氣相色譜檢測結果的線性方程為y=0.931 1x+0.045 4，相關系數R=0.989 9。結果說明氯氰菊酯檢測卡的檢測結果與氣相色譜檢測結果有良好線性相關，可以應用于對蝦中高效氯氰菊酯的檢測篩選工作。

表5 檢測卡與氣相色譜方法檢測對蝦中的高效氯氰菊酯結果

3 討論

時間分辨免疫熒光分析(TR-FIA)檢測方法是在ELISA技術上發展起來的，由于Eu原子受激發后熒光壽命較長(1 ms)，可以與本底受激發后產生的熒光明顯分開，因此利用Eu顆粒替代辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體，結合酶聯免疫技術和帶有時間分辨熒光模塊的酶標儀可以實現對抗原的高靈敏定量分析。如Aceti利用TR-FIA方法對人體血液中的HIV病毒進行分析，靈敏度達到100%[15]；Liang Qianni等用TR-FIA方法分析鼻咽癌標志物Barr病毒，檢測的線性范圍為0～30 Au/mL，檢出限為0.018 Au/mL[16]；Hiroko等用TR-FIA方法檢測抗肺炎支原體(MP)IgM和IgG，最低檢測限IgM為0.5 BU/mL，IgG為0.2 μB/mL；Huang Yukun等結合多色時間分辨熒光傳感器實現檢測牛奶中的多種葡萄球菌腸毒素(A、B、C1)目的[17]。

時間分辨免疫熒光層析技術是在時間分辨免疫熒光分析技術和膠體金免疫層析技術的基礎上開發的一種新的技術，結合熒光讀卡器可以實現對樣品的快速的高靈敏度定量分析。利用該技術對枯萎病菌(PSS)進行分析，最低檢測限為103CFU/mL，比ELISA方法的最低檢測限低100倍[18]。采用時間分辨免疫熒光層析技術檢測小麥、玉米、大豆和水稻等中的赭曲霉毒素A(OTA)，檢出限為1 μg/kg，與液相色譜檢測結果的相關系數R為0.985 4[19]。這些研究結果表明時間分辨免疫熒光層析技術無論是在檢測醫學還是在食品安全領域都有廣闊的應用空間。

4.5%高效氯氰菊酯乳油主要含有高效反式異構體(S 1R 3S和R 1S 3R)和高效順式異構體(S 1R 3R和R 1S 3S)，兩種高效體按4.5%的濃度配制而成[21]。這兩種高效異構體如圖6A～D所示[20]。氯氰菊酯人工抗原是由3-間苯氧苯甲酸(結構如圖6E所示)通過二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與血藍蛋白(KLH)偶聯獲得，制備的氯氰菊酯抗體可以與二苯醚結構結合。高效氯氰菊酯都含有二苯醚結構，因此可以通過氯氰菊酯抗體檢測高效氯氰菊酯。在水產品的氯氰菊酯的殘留主要也是以圖6中的4種高效氯氰菊酯異構體形式存在，所以本方法通過自制的氯氰菊酯抗體檢測水產品的高效氯氰菊酯總量。

本研究通過Eu顆粒標記氯氰菊酯抗體，研發針對高效氯氰菊酯檢測的時間分辨免疫熒光檢測卡，對高效氯氰菊酯的最低檢測限可以達到1 ng/mL或0.2 μg/kg，與邱明[22]等采用氣相色譜法(GC-ECD)檢測水產品中氯氰菊酯的最低檢測限一致，略高于國標GB 29705—2013對水產品中氯氰菊酯的最低檢測限(1 μg/kg)。 通過與國家標準方法檢測結果的相關性分析，本技術方法檢測結果符合預期要求。由于高效氯氰菊酯在農業上的廣泛使用，使動植物中經常會有高效氯氰菊酯的殘留，因此本技術方法在生態保護、食品安全等領域將具有重要的開發應用前景。

4 結論

本研究通過Eu顆粒標記可以與二苯醚結構特異性結合的氯氰菊酯抗體，研發針對水產品中高效氯氰菊酯檢測的熒光檢測卡，通過在對蝦樣品中添加高效氯氰菊酯標準品分析檢測卡的最低檢測限、準確度、精確度等指標，研究發現氯氰菊酯檢測卡的最低檢測限為0.35 ng/mL，檢測范圍是1～19.3 ng/mL，檢測卡的平均相對誤差在4.24%～8.66%之間，批內變異系數在3.0%～8.6%之間，批間變異系數在4.8%～6.6%之間，檢測卡檢測結果與氣相色譜檢測結果的線性相關系數R=0.989 9。結果表明本技術方法可以應用于水產品中高效氯氰菊酯的快速定量檢測。