基于雙殼貝類的多環芳烴生物標志物檢測技術的研究

卓藝蓉

(平潭綜合實驗區海洋與漁業執法支隊，福建 平潭 350400)

多環芳烴(PAHs)主要來源于有機物的熱解或不完全燃燒，是最早被發現和研究的致癌類化合物之一，其中以苯并(a)芘{B[a]P}最具代表性，該污染物會對海洋生物產生嚴重危害[1-2]。隨著海上石油和輪船運輸業的發展，我國海洋PAHs的污染日益加重，如青島膠州灣近岸海水和表層沉積物中的PAHs的含量分別為8.23～272.03 ng/L、82～4 562 ng/g，達到或接近中等污染水平[3]。目前我國許多沿海城市已將石化、造船、港口等產業集群作為優先發展的支柱產業，這些都可能成為持久性有害物質(PTS)的潛在污染源，必將對我國近海生態環境安全和人類健康帶來潛在的風險。

已有研究表明PAHs進入生物體后首先與芳烴受體(AhR)結合，之后經過細胞色素P450酶系(CYP450s)如芳烴羥化酶(AHH)等代謝轉化為更具極性的Ⅰ相代謝中間產物，這些代謝產物在Ⅱ相代謝酶的催化下進一步與內源物質分子結合，加快了代謝產物排出體外的速度[4]。另一方面在解毒代謝過程中產生大量的活性中間產物和自由基，在一定范圍內，這些自由基能被體內抗氧化防御系統如超氧化物歧化酶(SOD)等清除，當抗氧化防御系統不能消除這些活性氧時，會造成DNA損傷等毒性效應[5]。呂晏鋒等[6]的研究結果表明多環芳烴類污染物中的菲鯉魚的亞急性毒性作用顯著；崔培等[7]通過研究萘暴露下牙鲆肝臟抗氧化防御系統相關指標的變化，發現SOD、CAT及LZM的響應較AKP更為敏感。目前這些研究主要集中在哺乳動物和魚類中，有關貝類方面的研究較少[8-12]，而PAHs對菲律賓蛤仔分子生物標志物的研究報道也較少。本文擬研究B[a]P對菲律賓蛤仔消化盲囊和鰓絲毒理學指標的影響及DNA損傷效應，探討PAHs對菲律賓蛤仔的致毒機理，全面篩選用于PAHs毒性評定的生物標志物，為我國近海PAHs污染評價與監測提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用菲律賓蛤仔購于青島南山水產品市場，在30 cm×40 cm×50 cm的塑料水槽中暫養10 d，海水鹽度31，pH為8.1，溫度為15℃，連續充氣，日換水100%，養殖密度為300～400個/m3，并在換水后投喂螺旋藻粉，日投餌量6 g/m3。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗梯度的設置

通過HPLC測定，青島近海海域自然海水中B[a]P的濃度為0.155 ng/L，實驗中各濃度梯度的設置主要依據是污染水體中PAHs的濃度可能達到50.0 μg/L，而深海或未污染水域中PAHs含量一般低于1 μg/L[13]，實驗采用Sigma公司生產的B[a]P。首先將B[a]P溶解于一定量的3 μg/L丙酮(助溶劑)中，制備一定濃度的儲備液，再分別用自然海水配制濃度梯度為0、0.01、0.2 μg/L B[a]P實驗組，分別以未添加PAHs和只加入3 μg/L丙酮的自然海水處理組作為實驗對照組，所有實驗梯度均設3個平行組，各處理組丙酮維持相同濃度。

各實驗組分別用50 cm×40 cm×30 cm的塑料水槽盛放，從暫養的菲律賓蛤仔中挑選健康、活力強的菲律賓蛤仔放置于每個水槽中，每個水槽分別放置36只，實驗期間的養殖管理與暫養期間完全相同，換水時分別加入相應各實驗梯度的養殖用水，實驗期間菲律賓蛤仔無死亡現象。實驗開始后于0、1、3、6、10 d取樣。取樣時，每個梯度各水槽隨機選取6只菲律賓蛤仔，取鰓絲和消化盲囊于-80℃冰箱內保存，用于各實驗指標的測定。

1.2.2 樣品制備

酶液的制備：分別將菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊樣品約100 mg。置于pH=7.6 預冷的緩沖液(Tris20 mmol/L、蔗糖0.5 mol/L、KCl 0.15 mol/L、EDTA 1 mmol/L、10%甘油)，在冰浴中勻漿3 min，轉速為12 000 r/min，然后將勻漿液離心25 min，轉速為3 000 r/min，所得上清液即為酶液。

DNA提取：取菲律賓蛤仔鰓和消化盲囊各0.5 g，研磨剪碎后分裝，加入0.45 mL裂解緩沖液(50 mmoL/L Tris、100 mmoL/L EDTA、pH 8.0)和 80 μL 10%SDS。再加入2.5～5.0 μL(一般3 μL)蛋白酶K(20 mg/mL)，使其終濃度達100 μg/mL，混勻。55℃水浴3 h至過夜。樣品中加入150 μL飽和NaCl，室溫13 000 rpm離心20 min(T=15℃)，去沉淀。配制PCI抽提液，加入等體積苯酚抽提，輕輕混勻，靜止5 min。4℃、13 000 rmp離心10 min。將上層水相移入小離心管中，用PCI抽提液(苯酚∶氯仿異∶戊醇=24∶25∶1)重復抽提2次。加二倍體積(約0.5 mL)無水乙醇和1/10體積(150 μL)醋酸鈉(3 mol/L，pH 5.2)。在-20℃冰箱中放置3 h至過夜，13 000 rmp離心15 min，棄去表面相。最后用500 μL 70%乙醇洗滌2次，干燥，溶于600 μL TE(10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA)中。

1.2.3 解毒代謝酶活力的測定

芳烴羥化酶(AHH)活性的測定參照Walton(1978)[14]的方法：取170 μL 酶液，加入10 μL NADPH，200 μL Tris-HCl(0.1 mmol/L，pH 7.6，含MgCl2)緩沖液；放到30℃水浴鍋中預培養2 min，加入20 μL(2.5 mg/mL)PPO起始反應，反應液培養30 min；加入1 mL預冷丙酮終止反應；加3.25 mL正己烷萃取。吸出2 mL有機相，用5 mL水溶的(1 mol/L)NaOH反相萃取，取下層水相3 mL，用熒光分光光度計測熒光值(吸收355 nm/發射515 nm)。AHH活力單位：產物熒光強度/mg 蛋白。

谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)活性的測定參照Habig(1974)[15]的方法：按每孔150 μL 反應體系[0.05 mmol/L(pH 為6.9)磷酸鉀緩沖液100 μL；15.0 mmol/L CDNB 10 μL；15.0 mmol/L GSH 10 μL；20 μL 重蒸水；10 μL 勻漿液]和10 μL粗酶液加入96 孔微孔板，加入樣品30 s后，在溫度30℃、波長340 nm處時間間隔為20 s連續讀數6次。酶活力用每min每mg蛋白催化產生的2，4-dinitrophenyl glutathione 的nmol量來表示，單位nmol·min-1·mg-1pro。

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參照Marklund(1974)[16]的方法：pH=8.3、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液4.5 mL；0.1 mL樣液；10 μL 50 mmol/L連苯三酚，迅速搖勻；波長325 nm處每隔30 s測一次A值，使自氧化速率△A325nm/min控制在0.070 OD/min左右。單位用nmol·min-1·mg-1pro表示。

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)總量測定參照范崇東(2004)[17]的方法：取勻漿上清液100 μL，加入300 μL NaOH(0.15 mol/L)溶液，搖勻；加入體積分數3%甲醛(用水配)(pH=12)100 μL，搖勻，靜置2 min；加入500 μL DTNB (10 mmol/L)分析溶液，搖勻，在25℃水浴保溫5 min；測定在波長412(405、414)nm處的吸光度A，通過計算或從標準曲線上得出相應GSH濃度。酶活力單位(U)表示為每mg 蛋白的熒光強度。

1.2.4 DNA損傷的測定

雙鏈：取分離的雙鏈DNA 100 μL于試管中，加入100 μL 50 mmol/L NaCl，5 μL含0.2%SDS的2 mmol/L EDTA，3 mL 0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.9)，3 μL二苯丙咪唑，混勻后至于暗處反應15 min后測熒光；單鏈：取DNA 100 μL，于80℃加熱30 min，取分離的單鏈DNA 100 μL于試管中，加入100 μL 50 mmol/L NaCl，5 μL含0.2%SDS的2 mmol/L EDTA，3 mL 0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.9)，3 μL二苯丙咪唑，混勻后置于暗處反應15 min后測熒光；堿解旋：將分離純化的DNA樣品100 μL，加入50 μL 0.05 mol/L NaOH，混勻后于0℃孵育30 min。取出，快速加入50 μL 0.05 mol/L HCl，及2 μL 0.5%SDS，21號針頭吸放6次混勻。在上述堿解旋后的DNA樣品中加入3 mL 0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.9)，3 μL二苯丙咪唑(10 μg/L)，混勻后置于暗處反映15 min后熒光。

DNA完整性通常以F值表示，計算公式為：

F={X(auDNA)-XL(ssDNA)}/{XL(dsDNA)-XL(ssDNA)}

式中，X為熒光值；dsDNA為雙鏈DNA；ssDNA為單鏈DNA；auDNA為解旋后的DNA。

1.3 數據統計分析

所有數據均以3個平行組數據的平均值±標準差(Means±SD)表示，并采用SPSS軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗法統計分析。

2 實驗結果

2.1 B[a]P對菲律賓蛤仔組織解毒代謝酶活力的影響

由圖1可見，菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊AHH、GST活力受B[a]P誘導發生顯著變化(P<0.05)，而對照組無明顯變化。所有處理組組織AHH活力均表現為顯著的誘導作用(P<0.05)，于3 d達到最大值，然后趨于穩定。各處理組組織GST活力在實驗時間內呈先升高后下降趨勢，分別于1 d、3 d時達到最大值和最小值，然后保持穩定，并顯著低于對照組水平(P<0.05)。同時各處理組組織AHH活力在穩定后與B[a]P濃度呈正相關性，GST活力在穩定后與B[a]P濃度呈負相關性。

圖2表明，暴露于B[a]P環境中的菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊GSH含量、SOD活力被顯著誘導和抑制(P<0.05)，而對照組無明顯變化。所有處理組組織GSH的含量均表現為顯著的抑制作用(P<0.05)，于1 d達到最小值，然后趨于穩定。各處理組組織SOD活力在實驗時間內呈先升高后下降趨勢，分別于3 d、6 d時達到最大值和最小值，然后保持穩定，恢復至對照組水平。

2.2 B[a]P對菲律賓蛤仔組織DNA單鏈斷裂水平的影響

圖3表明，各處理組菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊DNA損傷(以F值表示)顯著(P<0.05)，而對照組無明顯變化。各染毒處理組組織F值隨著實驗天數的增加而明顯下降。在鰓絲處理組中，染毒1 d后F值迅速降低，在3 d后達到最低值，然后趨于穩定。而在消化盲囊處理組中，0.01 μg/L處理組在染毒后F值逐漸降低，6 d時達到最低值；0.20 μg/L處理組在染毒后F值迅速降低，在第3 d達到最低值，然后趨于穩定。各處理組組織F值在穩定后，均與B[a]P濃度呈顯著負相關(P<0.05)。

注：紫色線段表示染毒3 d時各指標實驗數據的劑量效應關系圖；綠色線段表示染毒10 d時各指標實驗數據的劑量效應關系圖。

Notes：The purple line segment represented the dose-effect relation diagram of the experimental data of each index at 3 days after the exposure.The green line segment represented the dose-effect diagram of the experimental data of each index at 10 days of exposure.

表1 在染毒3 d時菲律賓蛤仔解毒代謝和DNA損傷指標與B[a]P的相關分析

2.3 菲律賓蛤仔組織解毒代謝和DNA損傷指標與B[a]P濃度的相關性

由圖4、表1可知，除菲律賓蛤仔鰓絲GSH含量這個指標外，其他指標(鰓絲的AHH、GST、SOD活力和DNA損傷，消化盲囊的AHH、GST、SOD活力和GSH含量和DNA損傷)在B[a]P暴污3 d時與B[a]P濃度均呈明顯的線性關系，其中鰓絲和消化盲囊AHH和SOD活力與B[a]P濃度呈顯著的正相關，GST活力、GSH含量、DNA損傷與B[a]P濃度表現為明顯的負相關。

表2 在染毒10 d時菲律賓蛤仔解毒代謝和DNA損傷指標與B[a]P的相關分析

由圖4、表2可知，除鰓絲GSH含量和消化盲囊DNA損傷這兩個指標外，菲律賓蛤仔在B[a]P污染環境中暴污10 d時，其組織AHH、GST、SOD活力和GSH含量、DNA損其傷與B[a]P濃度均呈明顯的線性關系，其中鰓絲和消化盲囊AHH和SOD活力與B[a]P濃度呈顯著的正相關，GST活力、GSH含量、DNA損傷與B[a]P濃度表現為明顯的負相關。

3 討論

3.1 B[a]P對菲律賓蛤仔組織解毒代謝酶活力的影響

研究表明，持久性有機污染物(Persistent organic pollutants，POPs)通過Ⅰ相細胞色素P450酶(Cytochromep 450，CYP450)代謝成為更具極性的代謝中間產物進入生物體內，這些代謝產物在Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽-S-轉移酶等催化下與內源性分子結合，加快了代謝產物排出體外的速度；另一方面在POPs代謝過程中產生大量的自由基，可被體內抗氧化防御系統(如SOD等)清除。

馮濤等[18]和王靜等[19]分別對大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)解毒代謝酶活力進行研究，發現多環芳烴類(PAHs)可誘導上述兩種水產動物組織AHH活力顯著升高，并且其變化規律與PAHs暴污濃度呈現明顯的劑量-效應關系。吳偉等[20-21]通過鯽魚(Carassiusauratus)暴露于BDE-47中來研究魚體的抗氧化防御系統，研究發現鯽魚肝臟GST活性呈現先增加后減少的變化趨勢，而總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化歧化酶(SOD)活性隨著BDE-47濃度的增加，其活性逐漸降低，說明BDE-47對魚體造成明顯的氧化損傷；吳偉等[22]還對羅非魚(Oreochromisaurea)肝臟組織非酶類抗氧化劑進行了研究，發現在溴氰菊酯的污染下，羅非魚肝臟組織GSH含量呈現先增加后減少的趨勢，說明溴氰菊酯對羅非魚抗氧化防御系統產生了影響。因此認為解毒代謝酶活力和抗氧化防御系統可以在環境污染監測體系中起到預警作用。

本實驗結果表明，菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊解毒代謝酶AHH活力對B[a]P污染比較敏感，能夠在短時間內被迅速誘導上升，且誘導水平與污染濃度呈現正相關，這個結果和其他研究者在魚類和櫛孔扇貝AHH活力的研究結果相似[18-19，23-24]。而抗氧化防御系統的標志物GST活力、SOD活力和GSH含量，在受低濃度B[a]P污染時，GST和SOD活力首先呈現被誘導升高的趨勢，接著受到抑制下降，分別在3 d和6 d達到穩定值，達到平衡以后GST活力與B[a]P的濃度呈負相關，SOD活力最終恢復到對照組水平；GSH含量在一開始染毒就呈現出被顯著抑制的趨勢，在1 d后達到穩定值，穩定后GSH含量與B[a]P濃度呈現負相關。菲律賓蛤仔鰓絲和消化盲囊AHH、GST、SOD活力和GSH含量對B[a]P污染表現出了較強的敏感性，且變化出現較強的規律性，這顯示菲律賓蛤仔解毒代謝酶和抗氧化防御系統的標志物能指示外界B[a]P的污染程度，具有重要的參考意義。

3.2 B[a]P對菲律賓蛤仔組織DNA單鏈斷裂水平的影響

正常的遺傳方式下，DNA半保留復制的特性將遺傳物質傳遞給下一代，確保了DNA基因組的穩定性，也確保了有機體的正常新陳代謝和繁殖。但當正常的生長環境被破壞時，例如存在化學誘變物、電離輻射、代謝過程中產生的活性氧自由基或發生光化學反應、氧化還原反應等，生物細胞內的DNA分子可能會被損傷。本實驗重點研究了化學物誘導的DNA損傷，化學物進入生物體內，經細胞新陳代謝產生中間產物，與DNA結合形成加合物，導致DNA單鏈斷裂。B[a]P進入生物體，經細胞新陳代謝生成具化學活性中間產物，如二醇環氧化物{B[a]PDE}[25]，B[a]PDE可與DNA形成穩定或不穩定加合物，導致DNA鏈上的堿性不穩定位點，引發DNA鏈斷裂[26]。

本實驗采用了堿解旋技術測定了受到不同濃度及時間B[a]P脅迫的菲律賓蛤仔鰓及消化盲囊的DNA單鏈斷裂程度，由實驗結果可以看出，B[a]P可誘導菲律賓蛤仔鰓和消化盲囊DNA產生明顯的損傷效應，隨著B[a]P濃度和染毒時間的增加，F值逐漸減小，即DNA受損傷的程度加深，并表現出較好的時間-劑量效應。因此，作者認為菲律賓蛤仔組織暴露于B[a]P污染物中DNA損傷效應明顯，DNA損傷水平可以作為B[a]P污染程度的生物效應指標。

3.3 基于菲律賓蛤仔多環芳烴生物標志物的篩選

近年來，大量的染毒實驗證明生物體的某些指標與環境中的污染物呈現較好的敏感性和相關性，因此利用生物體的某些指標來反映污染物污染程度的方法已經得到了廣泛的認可和應用。Versteeg等[27]和Cooper等[28]提出了評估生物標志物的14條通用標準；Cheung等[29]將這14條標準進一步簡化概括總結為四條：1)生物標志物可以被環境中污染物的實際濃度所誘導；2)生物標志物的變化與不同污染物濃度之間存在明顯的劑量效應；3)生物標志物具有穩定性；4)生物標志物不受季節變化的影響。

根據菲律賓蛤仔的解毒代謝過程和B[a]P對機體的毒性效應，本文逐步篩選和分析AHH活力、GST活力、GSH含量、SOD活力和DNA損傷這5項指標。本文前兩個討論結果表明，在外界環境被B[a]P污染的情況下，上述5項指標均被誘導，并呈現時間-劑量效應關系(P<0.05)，這一變化情況符合Cheung等[29]所提出的生物標志物的第一、第二兩點要求。但海洋環境的多變和生物體自身的復雜，導致單一的生物標志物可能很難準確地評估環境污染程度，因此可以考慮結合兩個或三個生物標志物形成綜合生物標志物。總結本次研究，依據實驗中菲律賓蛤仔兩種組織各項解毒代謝酶活力被誘導的情況以及DNA損傷情況，認為可以整合解毒代謝酶AHH活力和DNA單鏈斷裂水平兩項生物標志物形成一個組合作為評估B[a]P污染程度的生物標志物，將AHH活力作為防御型生物標志物，DNA單鏈斷裂水平作為損傷型生物標志物，在兩個方面、雙重保障的情況下對環境中B[a]P的污染程度作出精確地評估，為我國海洋環境中多環芳烴的污染監測提供有效、確實可行的技術支撐。