分子標記選擇改良水稻兩系不育系創5S稻瘟病抗性

廖常青，陳 英，向 聰，雷東陽*

（1湖南豐神農業科技有限公司，長沙 410000；2湖南農業大學農學院，長沙 410128）

稻瘟病是水稻生產中破壞程度最大的病害，目前已經成為影響水稻高產優質的重要因素之一［1］。用農藥防治稻瘟病會造成環境污染和農藥殘留。目前，培育帶有稻瘟病廣譜抗性基因的水稻是防治稻瘟病最環保并且經濟有效的方法［2］。但是稻瘟病的變異較快，抗稻瘟病品種在推廣3～5年后，毒性菌株漸漸成為優勢小種，最終使品種抗性喪失。主要是因為抗病品種所攜帶的抗病基因抗譜較窄，病害遇到易發病的環境時就會迅速蔓延［3］。因此，培育出性狀優良的抗稻瘟病品種是育種專家追求的目標。

兩系不育系創5S不育性較穩定，可恢復性較好，不育起點溫度低，株型理想，配合力較強并且異交結實好［4］。由于稻瘟病生理小種近年來不斷產生變異，導致創5S對稻瘟病的抗性逐步衰退。抗性基因的成功導入可以顯著提高品種抗性和抗譜，而MAS是實現抗性基因導入和篩選的有效方法［5］。Pigm是一個廣譜稻瘟病抗性基因，來源于持久抗稻瘟病品種谷梅4號，目前該基因已經被克隆，其抗性比公認的 Pi1，Pi2，Pi3／Pi5廣譜抗性更加廣泛［6］。江南［7］通過對 Pi40（t）進行抗譜分析，精細定位，最終將該基因精細定位于標記T3和CG5E－Pi2之間。本研究擬通過雜交、回交和分子標記輔助選擇將IR65482中的廣譜抗稻瘟病基因Pi40和谷梅4號中的廣譜抗稻瘟病基因Pigm導入到水稻兩系不育系創5S中，定向改良水稻兩系不育系創5S，旨在培育出綜合性狀優良、具有持久抗性的水稻改良不育系，為抗病雜交水稻新品種的培育提供優良的抗性親本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 技術路線

以兩系不育系創5S為受體，通過與谷梅4號和IR65482兩個供體親本雜交，并以創5S作為輪回親本連續回交直到BC3F1代。每次回交均篩選目標單株與輪回親本回交，篩選到的目標單株須含供體抗性基因，且農藝性狀與輪回親本相似。BC3F2世代利用分子標記技術篩選攜帶純合目的基因的單株，各個世代在利用分子技術選擇目的基因的同時，篩選植株農藝性狀接近輪回親本的優良株系，最后對BC3F2株系進行稻瘟病抗性鑒定并與親本進行農藝性狀的比較（圖1）。

圖1 抗性改良技術路線圖Fig.1 Technical roadmap for improved resistance to rice blast

1.2.2 基因型鑒定

據已有的研究基礎［8，9］，挑選與目標基因 Pi40和Pigm緊密連鎖的標記 Indel3、RM527、RM3330、ZJ58、RM7311對目標基因在受體親本和供體親本之間進行多態性篩選，目的是篩選到在親本之間多態性較好的引物。

PCR總反應體系含0.2μmol／L正、反向引物各0.2μL、5μL 2×EasyTaqSuperMix、1μLDNA模板及3.6μLddH2O。引物RM527和 RM7311的PCR反應程序為：94℃預變性5 min后進行35個循環擴增，循環條件為 94℃變性 30 s，58℃復性 30 s，72℃延伸1 min，最后在72℃中延伸5 min，4℃下保存。PCR擴增產物在2%濃度下的瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離結束后放置于凝膠成像系統中，拍照并記錄。

1.2.3 稻瘟病鑒定

改良株系的稻瘟病抗性鑒定在湖南省瀏陽市大圍山抗性鑒定圃進行。此地區屬中亞熱帶季風濕潤氣候，7月平均氣溫28.9℃，海拔約400 m，空氣濕度大，是稻瘟病高發區域。供試材料2017年5月8日播種，6月10日移栽，每份材料按照6行×8株單本插，株行距20 cm×25 cm，順序排列，無重復，四周栽插對照感病品種CO39，9月下旬日進行稻瘟病抗性調查。葉瘟病級、穗瘟發病率、穗瘟損失率和穗瘟病級均按照國家標準進行記錄。分蘗盛期調查葉瘟，求出加權平均值即為發病等級，收種前調查穗瘟發病率和損失率，調查穗數不少于80穗。稻瘟病抗性鑒定標準和方法采用綜合指數法，即葉瘟病級、穗瘟發病率和損失率病級的加權指數（表1）。

表1 稻瘟病抗性評價綜合指數Table 1 Composite index for blast resistance evaluation

1.2.4 農藝性狀考察

零售企業配送中心建設首先要考慮配送中心的選址，考慮政策、地租、氣候、與企業上下游的距離、交通、門店分布等各方面情況，綜合考量采取重心法選擇合適配送中心地理位置；接著投入大量的資金購買必要的物流設施和設備，必須建成完善的網絡信息系系統；配送中心的建設需要軟件硬件的配合，除了硬件設施、設備外，還需要員工具有現代化的物流職業素養，只有軟硬件的默契配合才能夠實現配送中心的合理運營。

將改良株系與輪回親本創5S種植在相同條件的試驗田中，隨機選取創5S、各改良株系各15株（不取邊行）。主要考察株高、單株穗數、劍葉長、劍葉寬、劍葉角度、穗長、每穗總穎花數、柱頭外露率等性狀。將親本創5S作為對照，比較改良株系與親本創5S的性狀差異是否顯著。

1.3 數據分析

采用DPS軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 多態性引物篩選

圖2A中引物多態性篩選結果顯示，RM7311在受體親本創5S中擴增出的產物較大，而在供體親本谷梅4號中擴增出的產物較小，受體和供體之間的PCR產物帶型具有明顯的多態性。表明RM7311在谷梅4號和創5S間具有較好的多態性，該標記能夠有效地應用于各回交世代的分子標記輔助選擇。

圖2B中引物多態性篩選結果顯示，RM527在受體親本創5S中擴增出的產物較小，而在供體親本IR65482中擴增出的產物較大，受體和供體之間的PCR產物電泳帶型間差異明顯。表明RM527在IR65482和創5S間具有較好的多態性，該標記能夠有效地應用于各回交世代的分子標記輔助選擇，并能篩選到含有目的基因的抗性單株。

Pigm、Pi40基因的連鎖多態性分子標記及引物序列如表2所示。

表2 水稻稻瘟病抗性基因的連鎖標記及引物序列Table 2 Linked markers of blast resistance gene and it’s primer sequences

圖2 稻瘟病抗性基因引物篩選結果Fig.2 Primer screening result of rice blast resistance gene

2.2 分離世代株系基因型檢測

利用多態性分子標記RM7311和RM527對不同回交世代群體進行基因型選擇，在3個回交世代中，雜合帶型與受體親本純合帶型的基因型分離比例基本表現為1∶1。在改良過程中，需要有足夠規模的基礎群體，以確保能夠篩選到綜合性狀優良且含有目的基因的不育系單株。

在回交世代群體BC3F1中，選擇了6個農藝性狀與受體親本創5S相似的優良單株，其中含抗性目的基因Pigm的改良不育系3個（17S10、17S11和17S13），含抗性目的基因 Pi40的改良系 3個（17S16、17S18、17S19），自交獲得 BC3F2代不育系種子，繼續利用分子標記RM7311和RM527分別進行檢測，部分植株的基因型結果如圖3。

圖3 利用Pi40和Pigm改良創5S稻瘟病抗性BC3 F2世代的分子檢測結果Fig.3 Molecular test result of Improved Chuang 5S carrying Pi40 and Pigm in BC3 F2 Generation.

2.3 改良株系稻瘟病抗性鑒定

2017年夏季將創5S改良后代BC3F2代株系種植于大圍山稻瘟病病圃進行田間抗性鑒定。結果表明，受體親本創5S的葉瘟為5級，供體親本谷梅4號為2級，IR65482為3級（表3）。利用谷梅4號改良創5S的3個不育系株系，17S10葉瘟為4級，17S11和17S13葉瘟為3級；其穗瘟病級3～5級，表現中等抗病至中感病，而創5S的穗瘟發病率為45.5%，表現感病，改良株系的穗瘟病發病率平均較創5S降低了74.8%，3個改良株系的穗瘟損失率平均較創5S降低了82.0%。3個改良株系的綜合抗性指數2～2.8，所改良的3個株系的綜合抗性指數均略低于谷梅4號，但較受體親本創5S顯著提高（平均提高了58.7%）。利用IR56482改良的3個不育系株系中，17S16、17S19葉瘟均為4級，17S18葉瘟表現為3級；其穗瘟發病率為8.0%～20.4%，穗瘟病級3～5級，表現中抗病至中感病，3個改良株系的穗瘟病發病率平均較創5S降低了73.0%；綜合抗性指數為2.0～2.8，綜合抗性稍弱于谷梅4號，但較受體親本創 5S顯著提高（平均提高54.0%）。

從表3可知，谷梅4號的綜合抗性略強于IR65482，將谷梅4號中的抗性基因Pigm導入創5S后獲得的改良系，其綜合抗性基本上強于將抗性基因Pi40導入創5S后所獲得的改良系。田間抗性鑒定結果表明，利用分子標記輔助選擇技術對創5S的稻瘟病抗性改良是成功的。

表3 創5S改良后代BC3 F2株系的稻瘟病鑒定結果Table 3 Identification of rice blast resistance line of improved Chuang 5S

2.4 改良株系農藝性狀考察

由表4可知，各改良株系基本保持了受體親本的優良性狀，部分性狀甚至優于受體親本創5S。利用谷梅4號改良創5S的3個不育系株系中，17S10農藝性狀略優于對照創5S；17S11的單株穗數、劍葉角度和每穗總穎花數顯著優于對照；17S13的穗數和每穗總穎花數等顯著優于對照，但劍葉略長于對照。

利用IR65482改良的3個不育系株系中，17S16劍葉角度顯著優于對照創5S；17S18劍葉角度顯著優于對照，但劍葉略長于對照。

以上結果表明，在各株系中，含Pi40基因的改良系17S18不僅在抗稻瘟病性方面顯著高于創5S，而且其他農藝性狀與創5S相當。含Pigm基因的改良系17S11不僅抗稻瘟病性顯著高于創5S，而且其他農藝性狀已接近或優于創5S。

表4 改良不育系與親本農藝性狀比較Table 4 Com parison of agronom ical traits of im proved sterile lines w ith parents

3 討論

由于稻瘟病對水稻的危害性極大，培育性狀優良且抗稻瘟病的水稻品種成了育種家們追求的目標。隨著生物技術的迅猛發展，分子標記技術等方法很大程度上促進了水稻遺傳育種工作［10，11］。本研究利用分子標記技術結合田間表型鑒定和農藝性狀選擇，將抗病效果好的目的基因導入到生產上應用廣泛但抗病性相對欠佳的兩系不育系創5S中，在BC3F2世代篩選到了農藝性狀與受體親本創5S基本相似且含抗性目的基因的單株，這些改良不育系抗性較創5S有了顯著提高，說明利用分子標記輔助選擇技術改良水稻稻瘟病抗性是有效可行的，并證明了含有Pigm或Pi40基因的改良系稻瘟病抗性好，其中含Pigm改良系的抗性效果更佳。

但是在研究中發現，同一世代含相同抗性基因的不同改良系的田間抗性表型略有差異，如不育系改良系17S18含有Pi40基因，表現為抗稻瘟病，而改良系17S16和17S19表現為中抗稻瘟病。這種現象可能是由于谷梅4號對稻瘟病的抗性并不是只有Pigm起作用，很可能在Pigm附近還存在一些未被發現的與其緊密連鎖的稻瘟病抗性基因，而在導入Pigm的過程中由于染色體遺傳交換，那些未被發現的但發揮作用的抗性基因片段因此而丟失，造成遺傳背景相同、抗性基因也相同的材料之間的抗性發生差異。

本研究結果表明，兩系不育系創5S導入稻瘟病抗性基因Pigm和Pi40后得到的改良系稻瘟病抗性都有了顯著提高。利用分子標記選擇技術，初步創制出幾個導入單個稻瘟病基因的改良系，為培育抗稻瘟病雜交稻新品種提供了抗性親本材料，也為進一步培育持久、廣譜的抗稻瘟病水稻新品種提供了優良的中間材料。