苜蓿斑點病病原菌分離鑒定及紫花苜蓿品種的抗性篩選

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(北京林業大學林學院，北京 100083)

紫花苜蓿有“牧草之王”的美稱[1]，因其適應性、抗逆性及營養品質突出而在世界廣泛栽培，在畜牧業中具有重要的作用。隨著品種單一化以及規模化和集約化的生產，苜蓿的病害也越來越嚴重，其嚴重地降低了牧草的品質和產量[2]，造成了較大的經濟損失[3]。苜蓿病害研究在我國起步較晚，直到上世紀70年代才開始進行系統的研究[4]，當前多種病害研究資料依然匱乏，因此，加強苜蓿病害研究是我國苜蓿安全生產的重要保障之一。

苜蓿斑點病可嚴重降低苜蓿產量和飼用價值，鏈格孢菌(Alternariasp.)是苜蓿斑點病的病原菌之一。Naseri等[5]2000年在Kheirabad對生長期具有斑點病癥狀的苜蓿進行了病原物分離，發現發病苜蓿植株的葉、莖、根等器官中均含有鏈格孢菌，并證明其可產生降低飼草品質的真菌毒素。鏈格孢菌作為苜蓿斑點病的病原菌的描述記載較多[6-7]，但國內的系統研究報道目前還較少。2010年，國內首次報道鏈格孢引起的苜蓿斑點病，并分離得到交鏈格孢(Alternariaalternata)[8]。由于鏈格孢屬分生孢子的形態學特征易受外界環境影響，因此根據形態學觀察難以對鏈格孢屬進行種級分類；但隨著分子生物學的發展，利用內轉錄間隔區ITS和 OPA2-1核苷酸序列對苜蓿斑點病鏈格孢屬病原菌種一級的分子鑒定已有報道[9]。

目前，交鏈格孢菌斑點病尚無抗性品種育出，因此主要依賴化學防治[10]。抗病育種是防治病害提高牧草效益的核心手段之一。由于每一種病原物的致病機理都有其獨特的遺傳特性，則篩選出對應病原物的抗性材料是培育抗病品種的關鍵。抗病篩選的方法主要有孢子懸浮液接種法和離體葉片接種法，前者具有準確、快速的優點，后者便于控制環境條件且差異明顯，都廣泛地用于抗病性評價[11-12]。除接種方法外，抗病相關酶活性變化的生理指標也可用于抗病性評價[13]。苯丙氨酸解氨酶PAL是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，參與多種抗菌化合物的合成。多項研究表明PAL酶活性與抗病性呈正相關，因此苯丙氨酸解氨酶活性可用于抗病性評價[14]。

根據對北京林業大學順義草地植物實驗站中紫花苜蓿的病害調查，苜蓿斑點病發生極其嚴重，本研究對該實驗站中苜蓿斑點病的病原菌進行了分離鑒定，并將其侵染21個紫花苜蓿品種，綜合評價這些品種對該病原菌的抗病性，為我國苜蓿斑點病的抗病性研究奠定基礎，也為生產中選擇對苜蓿斑點病抗性強的苜蓿品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2017年4月11日于北京林業大學八家試驗地大田分區播種21個紫花苜蓿品種(表1)，進行常規田間養護。

表1 紫花苜蓿品種及編號Table 1 Alfalfa varieties and numbers

1.2 菌種材料

1.2.1采樣及病菌分離 2017年6月于北京林業大學順義草地植物實驗站采集苜蓿典型病樣，采用常規組織分離法[15]對病原菌進行分離，多次純化獲得純菌株。

1.2.2病原菌分子鑒定 病原菌DNA提取利用試劑盒(OMEGA E.Z.N.ATM Fungal DNA Mini Kit)進行。 采用真菌核糖體內轉錄間隔區通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[16]、小分子鏈格孢特異引物OPA2-1R(5’-TGCCGA GCTGTCAGATAATTG-3’)和OPA2-1F(5’-GCCGAG CTGGTGGAGAGAGT-3’)[17]進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μl，DNA模板為1 μL，上下引物各1μL，ddH2O 9.5 μL。反應程序為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環，72℃延伸5 min。

PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，擴增產物送該公司測序，測序結果在NCBI數據庫中進行登錄和比對。

1.3 接種方法

采用孢子懸浮液接種，參考袁慶華[11]等方法并加以改良，用血球計數板計算孢子濃度，制成濃度約為1×106個·ml-1的孢子懸浮液。

1.3.1離體葉片接種 參考李洪建[18]關于苜蓿莖點霉葉斑病的離體葉片接種方法，并稍作修改。選取無病且長勢良好的植株，以復葉為單位采集相同部位葉片，每個培養皿放置4片大小相似的復葉，每處理3皿，設3次重復。每天噴霧蒸餾水以保證培養皿內濕度。

1.3.2田間接種 選取長勢一致、健康的苜蓿植株，采用孢子懸浮液噴霧接種，套袋遮光保濕24 h后去袋，對照噴霧等量蒸餾水，每處理10株，設3次重復。

1.3.3離體枝條水培接種 選取健康枝條于蒸餾水中水培，采用孢子懸浮液噴霧法接種，遮光保濕24 h后放置在27℃，80%濕度的光照培養箱中，于4天后取相同部位葉片測PAL酶活性。對照噴等量蒸餾水，設3次重復。

1.3.4病情測定

1.3.4.1 發病率

發病率的統計方法是發病葉片占總葉片的比例。每天觀察發病情況。

1.3.4.2 分級標準

按每片小葉片病斑面積占總單片葉片面積的比例來分級測定病情。0級：無病斑；1級：病斑占葉片面積0～25%；2級：病斑占葉片面積26%～50%；3級：病斑占葉片面積51%～75%；4級：病斑占葉片面積76%～100%。

抗病級別實驗室離體葉片實驗病情指數<15為高抗，病情指數16～30為中抗，病情指數31～45為中感，病情指數>45為高感。

田間試驗擬抗病級別病情指數<5為高抗，病情指數5～10為中抗，病情指數10～15為中感，病情指數>15為高感。

1.3.5酶活性測定 PAL測定方法參考陳建隕[19]的方法，以每30 min A290增加0.01所需酶量為1個酶活性單位(U·g-1)，使用UV-2600分光光度計測量。為了消除材料本身的差異和測量之間的誤差，本試驗所測定的酶活性采用相對酶活性：

相對酶活性(%)=接菌株系酶活性/未接菌株系酶活性×100%

1.3.6隸屬函數計算方法 利用公式求出具體函數值，Zij為i苜蓿品種的j指標的隸屬函數值，Xij為i苜蓿品種的j指標值，Xjmin、Xjmax分別為21個供試品種j性狀指標的最小值和最大值。當j指標與苜蓿抗病性成正相關時，用(1)式；反之，當j指標與苜蓿抗病性成負相關時用(2)式。

Zij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin) (1)

Zij=(Xjmax-Xij)/(Xjmax-Xjmin) (2)

把21個品種大田實驗測得的病情指數、離體葉片實驗測得的病情指數和枝條水培取樣測得的PAL酶活性指標的隸屬函數值求平均值，值越大，抗性越強；反之越小。利用各品種指標隸屬值的大小來評價其抗病性強弱。

1.3.7數據分析 應用Excel、SPSS 22.0軟件對數據進行處理和作圖，采用one-way ANOVA進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 苜蓿斑點病癥狀及病原真菌形態特征

經實地調查分析，6月初苜蓿斑點病發生極嚴重，病葉占整個植株近70%，且所有植株都感病，感病植株表現出活力減弱，葉片萎黃；病斑正反面均為黑褐色，融合擴大表現出與褪綠暈環繞的同心區，周圍葉片黃化，表面平滑無凸出感，病斑直徑為0.1～0.6 mm，且病斑所占葉片面積按病害嚴重程度遞增，病情輕微的葉片僅葉尖發黃，嚴重時整個葉片發黃，對植株生長和苜蓿的品質造成極大影響。

對采集的病葉分離純化，在PDA平板培養基上培養，菌落前期灰白色，后期呈墨綠色，有絮狀氣生菌絲，分生孢子梗單生或簇生，有分隔；在顯微鏡下觀察分生孢子呈梭形、倒棍棒型、長卵型。有2～5個橫隔，0～3個縱隔，大小約為20 μm×10 μm，隔膜處稍有縊縮。根據分生孢子的形態特征初步鑒定為鏈格孢屬真菌(Alternariasp.)。

圖1 苜蓿斑點病發病癥狀及病原形態特征Fig.1 The symptoms of alfalfa Leaf spot and morphology of isolated pathogen注：A：苜蓿斑點病病葉癥狀；B：病原菌落形態；C：病原菌分生孢子(400×)Note：A：The symptom of alfalfa leaf spot；B：Isolation and culture of pathogen；C ：Conidia(400×)

2.2 分子鑒定結果

以病原菌DNA為模板，分別用ITS1/ITS4引物和OPA2-1L/OPA2-1R引物做PCR擴增，電泳后紫外凝膠成像(圖2)，條帶單一較亮，且無非特異性擴增條帶，將PCR產物進行雙向測序。

圖2 真菌基因組的DNA PCR檢測電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of fungal genomic DNA PCR test

通過分析rDNA-ITS和rDNA-OPA2-1測序比對的結果，將得到的序列導入Genbank中進行同源性比對，并結合形態學特征確認致病菌是交鏈格孢菌(Alternariaalternata)。

擴增的ITS序列結果(547bp)：

A C C T G C G G A G G G A T C A T T A C A C A A A T A T G A A G G C G G G C T G G A A C C T C T C G G G G T T A C A G C C T T G C T G A A T T A T T C A C C C T T G T C T T T T G C G T A C T T C T T G T T T C C T T G G T G G G T T C G C C C A C C A C T A G G A C A A A C A T A A A C C T T T T G T A A T T G C A A T C A G C G T C A G T A A C A A A T T A A T A A T T A C A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A G T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C T T T G G T A T T C C A A A G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T T G T A C C C T C A A G C T T T G C T T G G T G T T G G G C G T C T T G T C TC T A G C T T T G C T G G A G A C T C G C C T T A A A G T A A T T G G C A G C C G G C C T A C T G G T T T C G G A G C G C A G C A C A A G TC G C A C T C T C T A T C A G C A A A G G T C T A G C A T C C A C T A A G C C T T T T T T T C A A C T T T T G A C C T C G G A T C A G G T A G G G A T A C C C G C T G A A C T T A A G C A T A T C A

擴增的OPA2-1序列結果(599bp)：

C T G T C A G A T A A T T G A A G C T T T G A T G C T A A G A A A G T A G T T T A T T T G G T A T G A T G G T G G C T G T T G G G C G C A G C T A C C T T T A A G A A G G G T C C G C G A A G T T T A T G G C A A T G A G G T C A T G T C C G G T C T T T A C C G G C C A G C G C C A T T G T T G G G C G C G T C T C G T G C G A G T G C A T C G G G T G G A C G T G G G A C A C T G C A C C A T A G T A A C G C G A C G C G C T G C A T A C A C G C T G T T T G T C A G C C C A G G T G G C G T G A G G T A T C A G A T C T G C G G C G T G G T C T T G C T A C C G A A T G C G T G C G C T T G C A G C T C G A G G C T T C G T T T A C G C T C A C G A T T T T C T T C G T A C T A A C A C T G T T A T C G C G G C G T G G A A A T A A C T T G T A T C A A G C A C G A G A T T G T T G G T C A G A G T G G A A T C GA G A C A T T T G A A A G C G G G G C G C C T C G T G G G C C G T A C C A C T C C A T C C A C A T G T A T T T G G T C A A T C T G C A T C A T C A C C C G T C T A T C C A C A G C A G A A T C C C A A C A T T C A T C C A A G T C T G A A T T T T G C T A A T C A T A C A T C A G A A C G T G A A G A T C A C G A C C C A G C T C C C C G C A G C T T A T C T G C A G T C A T T T C C T G A A C T C T C T C C A C A A

2.3 離體葉片實驗篩選

離體葉片侵染后2～3 d有明顯發病葉片，8～10 d發病率趨于穩定，10 d后測定病情指數(圖3)。

由圖3可知，21份材料的病情指數為5.79～53.01；品種間存在顯著差異(P<0.05)，病情指數越小抗病性越強，‘英斯特’病情指數5.79，抗病性最強，其次是‘SK3010’病情指數6.02，‘北林201’病情指數7.87，‘皇冠’病情指數8.10；抗病性最弱的為‘新疆大葉’，病情指數高達53.01，其次是‘準葛爾’病情指數50.46，‘維多利亞’病情指數40.05，‘肇東’病情指數38.43；將所有21個品種分為以下四個抗性水平，高抗水平(病情指數<15)的編號為：3，5，6，7，8，12，15，16，17；中抗水平(病情指數16～30)的編號為：2，1，4，9，10，11，13；中感水平(病情指數31～45)的品種編號為：14，18，21；高感水平(病情指數>45)的品種編號為：19，20。

圖3 離體葉片實驗不同苜蓿品種的病情指數Fig.3 Disease index of different alfalfa cultivars in vitro leaf experiments注：品種編號參考表1；不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)；下同Note: Varieties number in Table1. Different small letters (P<0.05) are significant different among the treatment. The same as below

2.4 大田實驗篩選

大田實驗侵染一周后開始有病癥葉片，20 d后病情明顯測定病情指數(圖4)。

由圖4可知，21份材料的病情指數為0.49～29.75，品種間存在顯著差異(P<0.05)。抗性最強的為‘威神’，病情指數0.49，‘皇冠’病情指數0.62，其次是‘SK3010’病情指數0.74，‘MF4020’和‘Tango’的病情指數均為1.11，最易感病的品種為‘新疆大葉’病情指數29.75，其次是‘耐鹽之星’病情指數26.79、‘準葛爾’病情指數22.59。將所有21個品種分為以下四個抗性水平，高抗水平(病情指數<5)的品種編號為：2，3，5，6，7，8，13，14，15，16，17，18；中抗水平(病情指數5～10)的品種編號為：1，4，11，12，21；中感水平(病情指數10～15)的品種編號為：10；高感水平(病情指數>15)的品種編號為：9，19，20。

圖4 大田實驗不同苜蓿品種的病情指數Fig.4 Disease index of different alfalfa varieties in field experiments

2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性差異篩選抗感病

枝條水培實驗的葉片侵染后4 d病癥初現，各苜蓿品種葉片取樣測苯丙氨酸解氨酶活性(圖5)。

圖5 不同品種侵染后四天苯丙氨酸解氨酶(PAL)相對酶活性Fig.5 Relative enzyme activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) in four days after infestation of different cultivars

由圖5可知，品種間PAL相對酶活性存在顯著差異(P<0.05)，其中‘英斯特’相對酶活性最強，達到136%；其次是‘MT4015’，相對酶活性達131%；相對酶活性較低的是‘巨能7’和‘新疆大葉’，分別為82%和84%；‘巨能601’相對酶活性居中為100%。

利用生理生化指標進行抗病性鑒定是一種輔助性鑒定方法，許多研究表明，植物受到病原菌侵染后，一些代謝相關酶會發生一定的變化，這些變化與植物的抗病機制有關。多項研究表明[20]，PAL活性與抗病性呈正相關，因此可利用PAL活性來測定品種的抗病性，即PAL酶活性越高，抗病性也較強。由圖4可知，抗性較強(病情指數>110)的品種編號為：1，2，4，5，13，14，15，17，21；抗性中等(病情指數90～110)的品種編號為：3，6，7，9，11，12，16，19；抗性較弱(病情指數<90)的品種編號為：8，10，18，20。

2.6 利用模糊隸屬函數法綜合篩選

不同紫花苜蓿種質抗病強弱的程度可以通過隸屬函數值反映，值越大植株受病原菌影響越小，其抗病性就越強；反之，隸屬函數值越小，植株受病原菌影響越大，抗病性越弱。通過隸屬函數法綜合大田侵染實驗的病情指數、離體葉片實驗的病情指數和PAL相對酶活性指標進行了評價，對21個紫花苜蓿品種進行抗病性強弱的排序(表2)，抗性由強至弱分別為‘英斯特’>‘MT4015’>‘北林201’>‘Tango’>‘威神’>‘皇冠’>‘巨能995’>‘SK3010’>‘斯貝德’>‘Dryland’>‘MF4020’>‘巨能2’>‘巨能801’>‘巨能601’>‘巨能7-耐望’>‘維多利亞’>‘巨能7’>‘肇東’>‘耐鹽之星’>‘準葛爾’>‘新疆大葉’。

3 討論與結論

苜蓿有許多常見且危害嚴重的真菌病害，如霜霉病[21]、褐斑病[22]、銹病[23]、根腐病[24]等，近年來已有對這些病害進行了系統研究[25]。張麗[14]從苜蓿葉部病害分離到的苜蓿真菌中鏈格孢的分離頻率最高，但是致病性較弱，因此該病菌引起的苜蓿病害易受研究者忽視。

2017年6月，本研究通過對北京林業大學順義草地植物實驗站紫花苜蓿的調查發現一種葉部病害發生嚴重，對苜蓿的品質和產量造成了極大的影響，通過發病葉片的病斑觀察并結合顯微鏡下孢子形態觀察，初步確定病原菌為鏈格孢屬(Alternariasp.)，通過查閱文獻確定該苜蓿病害為苜蓿斑點病[8-9]。傳統的菌種鑒定方法易受到環境和人為因素的影響而表現不穩定且難以準確鑒定到種。真菌DNA堿基具有穩定性，借助PCR和測序等分子生物技術可以快速鑒定出真菌種類[25]。本實驗利用試劑盒提取了真菌DNA，分別利用引物ITS1/ITS4和OPA2-1R/OPA2-1F擴增出真菌核糖體ITS片段(547 bp)和OPA2-1片段(599bp)，經過Genbank比對結果均為交鏈格孢(Alternariaalternata)。

利用分離培養的真菌進行田間侵染、實驗室離體葉片法和水培枝條法侵染實驗，苜蓿發病癥狀均相似，葉尖發黃，病斑大小視嚴重程度而異，發病嚴重的葉片黃化、變干脫落(室外大田)、葉片變薄透明(離體葉片)，采集病葉重新鑒定真菌，仍為交鏈格孢菌，利用柯赫氏法則保證了實驗的準確性。本研究結合大田侵染實驗和室內侵染實驗，對21個紫花苜蓿品種對分離得到的鏈格孢做了抗性的初步研究，分析3種實驗方法，大田侵染、枝條水培侵染、離體葉片侵染后葉片病癥相似，但發病速度離體葉片>枝條水培>大田；離體葉片實驗易于控制100%濕度和最適宜孢子生長的溫度，3 d出現病癥，10 d發病率趨于穩定；枝條水培實驗控制80%的濕度和最適宜溫度，4 d天侵染成功出現癥狀；大田實驗視環境不可控因素影響未能達到最適發病條件，發病癥狀沒有實驗室條件控制下明顯，一周之后葉片出現病癥，病情指數低于實驗室條件下病情指數，但是大田侵染更接近自然發病條件，對于生產應用有直觀的參考價值。

寄主植物與病原真菌的相互作用具有復雜性，利用生理生化指標可作為抗病性評價的輔助性方法。本實驗利用苯丙氨酸解氨酶活性作為指標參與抗病性評價。結果表明各苜蓿品種PAL酶活性存在顯著差異(P<0.05)，與大田實驗和離體葉片實驗的病情指數評價抗感病結果存在極大相似度。

由于3種實驗的影響因素不同，所造成評價苜蓿抗病性的影響差異還有待研究。3種指標所占的權重無法準確衡量，利用模糊隸屬函數法，對3個指標隸屬值求平均來綜合評價21個紫花苜蓿品種的抗病性強弱，抗性最強的是加拿大進口的英斯特品種，抗性最弱的是本土新疆大葉品種，為生產中選擇對苜蓿斑點病抗性強的苜蓿品種提供了參考。此外，多品種的抗性差異，為深入研究紫花苜蓿對苜蓿斑點病的抗感機理奠定了基礎，有利于今后深入研究抗病機理，減小鏈格孢菌產生的霉菌毒素和植物毒素對苜蓿生產造成的危害。