遠隔缺血后適應對老齡大鼠骨折愈合的影響及研究

周萌，黃江，安帥，曹光磊*，沈惠良

(1.北京積水潭醫院骨科，北京 100035；2.首都醫科大學宣武醫院骨科，北京 100053)

隨著年齡的增長，骨丟失與骨形成的平衡逐漸被打破，破骨細胞的作用增加，骨吸收作用增強以維持機體內血鈣水平的穩定，同時伴隨著骨小梁稀疏以及骨皮質逐漸變薄，最終造成骨的微觀結構發生改變[1]。

骨骼的血供約占心輸出量的10%，具有高度的血管化[2]。骨折時，骨組織和細胞處于低氧環境中，而骨折愈合就是在這種缺血缺氧的環境中發生發展。在骨發育和再生過程中，血管的新生起到了至關重要的作用[3-4]。我們之前的研究中提到，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與其受體結合后可以發揮一系列促血管生成反應[5]。但血管新生是多個生長因子共同參與的復雜過程，不僅僅是由單個生長因子決定的，而低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作為上游調控基因比單個基因效率更高[6]。

HIF-1α是調節氧穩態的核心轉錄因子，在骨折愈合過程中，HIF-1α通路的激活是骨骼再生所需的新血管生成的關鍵介質，是血管與骨形成替代的關鍵調節因子，有研究表明應用HIF激活劑可以起到改善骨愈合的治療作用[7]。應用HIF-1α基因敲除的成骨細胞的小鼠骨折模型進行研究證實，當HIF-1α通路被激活時，成骨細胞的低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP )、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、I型膠原以及Runx2等表型增加，促進成骨功能；同時在HIF-1α的刺激下新生血管增加進而促進骨量、骨體積增加以及骨的形成[8-9]。

Zhao等[10]在2003年研究發現在再灌注的早期，經歷短暫的缺血再灌注處理的缺血心肌可以減少梗死體積，并且據此提出了缺血后適應的概念。Zhao等[11]在遠隔器官上應用IpsotC，并將其命名為遠隔缺血后適應(remote ischemic post-conditioning，RIPC)，整個過程中涉及到了腺苷、細胞自噬、HIF-1α、VEGF等的變化[12-13]。有研究表明，HIF-1α、VEGF作為重要因子參與了肢體缺血后適應的過程。

我們通過之前的實驗已經證實通過肢體缺血后適應造成的缺血缺氧環境可以促進成年大鼠的骨折愈合[14]，本研究我們采用老年大鼠來模擬老年患者的機體情況，進一步研究低氧環境是否能夠促進老年大鼠的骨折愈合。

1 資料與方法

1.1 老齡大鼠脛骨閉合骨折模型的建立 本次研究所涉及的動物實驗均經過首都醫科大學動物倫理委員會批準，SD老齡大鼠均來自首都醫科大學宣武醫院動物實驗中心。老齡大鼠的體重為(820±20)g，月齡18～20個月，均為雄性，每籠飼養一只，自由進食水，動物房飼養環境復合SPF級別，飼養室為恒溫恒濕環境，溫度控制在23～25℃，濕度控制在40%～60%。

將老齡鼠用2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉成功后，將左下肢外展外旋位放置于自制大鼠閉合骨折模型造模器的兩塊L型鐵砧凹槽中，將骨刀放置于下肢脛骨中上1/3部分，固定下肢。助手將600 g砝碼提高22 cm后松開砝碼，將力傳導至大鼠左下肢，進而造成脛骨中上1/3骨折。取左下肢髕前切口，縱行劈開髕腱，于脛骨平臺中后部電鉆開髓，并延髓腔方向插入1 mm克氏針，復位骨折后，將克氏針順行插入遠端，檢查骨折端無明顯臺階感后，折彎克氏針尾部，逐層閉合切口，以安爾碘涂抹切口。我們將64只老齡大鼠隨機分為兩組：肢體缺血后適應組(RIPC組)32只，對照組(Control組)32只。

1.2 肢體缺血后適應模型 我們應用首都醫科大學宣武醫院低氧研究所自行研發的大鼠肢體缺血適應儀對肢體缺血適應組進行缺血后適應干預。將儀器的18 mm袖帶綁在大鼠右下肢(手術對側)的大腿中部部分，加壓至240 mm Hg，阻斷局部血流，加壓10 min后由程序自動減壓至0 mm Hg，間隔10 min繼續加壓，往復3個循環。造模后當天即開始進行肢體缺血適應，每天兩次，每次間隔時間不小于4 h，連續干預14 d。為了檢測大鼠肢體缺血適應儀的有效性，我們應用激光多普勒血流儀(Periflux System 5000，Perimed AB，J?rf?lla，Sweden)對袖帶遠端動脈血流進行監測：袖帶加壓后，遠端血流可完全被阻斷；減壓后血流立即恢復(見圖1)。

圖1 大鼠肢體缺血適應儀加壓前后局部血流圖

1.3 Micro-CT掃描分析 在骨折術后第14天、28天以及42天每組隨機選取3只老齡大鼠，脫頸處死后，完整取下手術側脛骨，取出克氏針后放入多聚甲醛中固定48 h。應用首都醫科大學的Inveon Micro-CT(Siemens AG，Munich，Germany)對脛骨標本進行逐一掃描(層厚15 μm，500 μa，80 kv)，將數據導入Mimics 16.0(Materialise NV，Leuven，Belgium)進行三維重建，測得骨痂體積[15]。在矢狀位、冠狀位和軸位骨折線兩端各選取三個層面，每個層面在骨痂部分選取三個點測量灰度值進行統計分析。

1.4 生物力學檢測 將骨折術后28 d和42 d取下的完整脛骨標本應用SWD-10萬能試驗機(長春試驗機研究所)進行三點彎曲試驗檢測其力學性能[16]。將標本兩端進行包埋置于試驗機兩點支架上，兩點支架間的距離為8 mm，在速度為10 mm/min的負載下加載負荷。所檢測的指標包括最大負荷和強度。

1.5 Western Blot 取出液氮中凍存的骨折后各組的骨痂組織標本，每組5例，按Western-blot的標準操作步驟進行，蛋白質抽提和濃度測定，SDS-PAGE電泳，轉膜，加一抗鼠抗HIF-1α單克隆抗體(1︰1 000)和骨鈣素單克隆抗體(1︰800)過夜，加熒光二抗后緩沖鹽溶液洗膜，化學發光試劑顯色，用紅外線掃描成像系統(Odyssey，LI-COR)進行掃膜，觀察HIF-1α、VEGF、OCN、ALP和Runx2蛋白水平的變化。

1.6 RT-PCR檢測 RT-PCR檢測骨痂中HIF-1a、VEGF、Runx2、OCN和ALP mRNA的表達：取出液氮中凍存的骨折后7、14、28 d組的骨痂組織(包括骨折線上下各0.5 cm脛骨組織)標本，每組4例，研碎成粉末狀，按TRIzol試劑盒(Invitrogen)說明抽提骨痂組織的總RNA；取總RNA 2 μg，按PCR逆轉錄試劑盒(Envision)說明進行RNA逆轉錄；以RNA逆轉錄生成cDNA為模板進行PCR反應(Envision)，總反應體系為20 μL。PCR引物序列及反應條件見表1。應用ABI7900 System software SDS V2.3分析軟件系統在PCR反應終止后，檢測擴增曲線和光譜的是否有異常變化，進而評估本次實驗的重復性。對于每個樣品中的每個目的mRNA均進行三次重復試驗，進而取平均值。

表1 各目標基因引物序列

2 結 果

2.1 兩種低氧方式干預后骨組織重建和再生的影像學觀察對比 為評估和對比兩種低氧干預方式骨痂的質量以及骨折的愈合情況，我們對骨折后14 d、28 d、42 d的兩組老齡大鼠左下肢脛骨標本進行Micro-CT掃描。我們通過骨折后14 d脛骨橫軸方向的截圖可以看出低氧干預后骨痂體積明顯大于對照組，同時從骨折后42 d的三維重建圖來看低氧干預后老齡大鼠的脛骨塑形更好(見圖2)。經過Micro-CT的配套軟件以及Mimics的統計測量，在術后第14、28天和42天RIPC組的骨痂體積明顯高于對照組(P<0.01)(見圖3)；在術后第14、28和42天，RIPC組骨折線附近的灰度值明顯高于對照組(見圖4)，間接表明RIPC組骨折線附近的骨密度在各個時間點均高于對照組，換言之RIPC組骨痂部分的礦化速度以及骨折愈合程度均優于對照組。

2.2 生物力學檢測 為了進一步分析骨折愈合過程中的骨強度進而評估骨折愈合質量，我們通過三點彎曲試驗對骨折后28 d和42 d的兩組老齡大鼠脛骨進行了檢測。實驗結果表明相對于對照組，RIPC組大鼠脛骨標本所能承受的最大負荷和強度均有明顯優勢(P<0.05)(見圖5)，也就是說在同一時間點RIPC組的骨折愈合質量要優于對照組。這也印證了Micro-CT給出的結論，RIPC組相對于對照組來說對于骨折修復早期能夠更快的促進骨痂骨化，增強骨折局部的強度。

圖2 Micro-CT顯示兩組老齡鼠骨折后14 d和42 d骨痂情況

圖3 骨折后各時間點兩組的骨痂體積對比 圖4 骨折后各時間點兩組骨痂灰度值對比

圖5 骨折后28 d和42 d兩組老齡鼠脛骨最大負荷和強度對比

圖6 RT-PCR比較各時間點兩組老齡鼠骨痂組織中HIF-1α、VEGF、Runx2、ALP及OCN的mRNA水平

圖7 Western Blot比較各個時間點兩組老齡鼠骨痂組織中HIF-1α、VEGF、Runx2、ALP及OCN的蛋白表達水平

2.3 低氧干預激活HIF-1α通路進而激活VEFG以及下游靶基因來促進骨折愈合 我們應用PCR技術以及Western Blot技術檢測了骨痂組織中HIF-1α、VEGF以及相關下游靶基因的mRNA水平和蛋白含量。綜合Western Blot和PCR來看，如圖6～7所示，在術后第7、14和28天時，RIPC組HIF-1α的蛋白表達含量明顯高于對照組(P<0.01)。

同樣我們從VEGF的表達也可以得出相似的結論：在三個時間點，RIPC組的VEGF表達明顯高于對照組，RIPC組的相關靶基因ALP、OCN和Runx2的蛋白表達含量在三個時間點尤其是第14天和第28天明顯高于對照組。

3 討 論

正常骨折愈合是一種復雜的過程，影響骨折愈合有許多方面的因素，包括生物、營養、物理和遺傳因素。之前的研究表明缺氧可能促進骨折愈合和成骨細胞特異性轉錄因子Runx2以及成骨細胞特異性基因ALP和OCN的增加[17]。正是這些發現為促進誘導骨組織再生提供了潛在的方式。

3.1 遠隔缺血適應對機體的保護作用 遠程缺血調節已被證實可以誘導不同冠狀動脈區域的心肌保護[18]。Oxman等[19]報道了非侵入性的后肢缺血模型，并證明在持續缺血性損傷后可以減少大鼠心臟再灌注后的心律失常。由于這種模型操作簡便，副損傷小，許多研究已經開始使用這種方法進行相關的遠隔缺血適應(remote ischemic conditioning，RIC)實驗[20-24]，并且已經證實該方法可以減少動物和人類其它器官的損傷，并且具有可重復性[25]。近年來的國內外研究表明，HIF-1α及其靶基因VEGF在細胞中的穩定表達對缺血再灌注損傷可以起到抵抗作用[26]。在本研究中，在骨組織中檢測到了HIF-1α的上調表達。HIF-1α與缺氧反應元件靶基因啟動子上的5'-AGCGTG-3'的核心DNA序列相互作用，上調包括VEGF在內的多種缺氧敏感性基因[27-28]。

3.2 RIPC對骨折愈合相關因子的影響 本研究揭示了RIPC對Runx2的表達有積極影響，Runx2由于可以對成骨細胞的發育起到調節作用，同時對間充質細胞向成骨細胞系分化起到重要的調節作用，故被認為是成骨細胞分化的主要控制轉錄因子[29]，在成骨細胞早期分化過程以及間充質干細胞向成骨細胞轉化的過程中均起到了重要的作用。

在骨折修復的過程中，成骨細胞在低氧的誘導下表達HIF-1α，進而通過其信號通路促進成骨細胞分泌VEGF[30-33]。在基因水平上，HIF-1α可以直接調控VEGF及其受體的表達；此外在mRNA水平上，HIF-1α還可以通過增強VEGF的穩定性來提高其表達。本研究表明HIF-1α能夠促進Runx2的表達，分析其原因可能有以下兩個方面：a)VEGF通路介導。在軟骨內成骨的過程中，周圍血管依靠軟骨膜周圍以及肥大軟骨細胞的VEGF受體增加的共同作用侵入到軟骨當中，起到促進軟骨內骨化的作用。而VEGF也可以通過刺激成骨細胞的分化與遷移進而抑制成骨細胞的凋亡來上調Runx2的表達[34]，這與本實驗的結果相似；b)HIF-1α直接介導。有研究表明，在骨折后局部細胞聚集、成骨再生反應發生的階段可以觀察到HIF-1α升高，這表明對于促進成骨細胞的成骨分化功能，HIF-1α可以直接通過上調Runx2的表達而達到[35]。本研究顯示，Runx2的表達水平隨著HIF-1α的升高而升高，也印證了上述結論。因此我們可以推論出：為了達到促進成骨細胞分化的目的，HIF-1α不僅能夠直接促進Runx2的分泌，還能夠通過上調VEGF的表達進而促進Runx2的分泌。

Runx2和ALP是體內成骨所必需的，因而ALP是本研究的另一個重要因素[33，36]。ALP作為早期的分化標志，主要在成骨細胞中表達。而OCN是成熟成骨細胞的重要標志物，在成骨細胞祖細胞的分化中起到重要作用，在基質合成和礦化中可以觀察到明顯上調[37-38]。所以OCN和ALP的表達程度可以反應骨的修復形成過程。本研究證實，隨著VEGF和HIF-1α表達水平的升高，ALP與OCN的表達分泌也隨之增加，證明了OCN和ALP在成骨細胞中的表達可以通過上調HIF-1α而上調。一項針對兔成纖維細胞的研究表明，轉染Runx2后成纖維細胞也可以表達ALP與OC，這說明Runx2有間接調控OC和ALP的作用，也就是說HIF-1α是通過上調Runx2進而促進ALP與OC的表達和分泌。

3.3 RIPC對骨痂強度的影響 在本研究中Micro-CT證實，在骨痂形成階段(術后第14天)，RIPC組的骨痂體積明顯大于對照組，并且代表骨密度的灰度值也明顯高于對照組。在骨折后第42天，RIPC組的灰度值為(4 120±112)HU，更接近于正常皮質骨。愈合骨組織的生物力學性質可歸功于骨組織的密度和骨小梁的數量，生物力學分析顯示所能承受的最大負荷和強度均有明顯優勢。綜上所述，以上結果表明RIPC可以增強成骨細胞的增殖率和骨礦化的速度。

近年來，RIPC已經成為減少心肌缺血再灌注損傷的有效方式。使用短暫肢體缺血作為遠程調節刺激的方式促進了RIPC從實驗室到臨床的發展，并且在逐步開始各種臨床環境中應用[20]。本研究證實RIPC作為一種有效的方式可以用來幫助骨折愈合，并且有望作為一種切實可行的方式應用于臨床。然而，目前有關RIPC促進骨折愈合的分子機制還需進一步深入研究。