廣西欽州海鴨蛋中多環芳烴含量的測定

□ 李 薇 熊子成 馮曉斌 欽州市食品藥品監督管理局 黃 嫻 防城港市技術監測所 譚 晶 欽州學院

海灘養殖的海鴨通常以退潮后滯留在灘涂上的魚、蝦、蜆、蟹等水生動物為飼料，生長發育快，海鴨蛋產蛋率高。海鴨蛋擁有豐富的蝦青素、卵磷脂、蛋白質等對人體有益的物質，是一種天然的保健品。蝦青素是類胡蘿卜素的一種，具有很強大的保健功效，可加強人體抵抗衰老的能力。卵磷脂能夠保護肝臟、延緩衰老、預防肝硬化和老年癡呆、增強記憶力等。海鴨蛋中富含的蛋白質多種多樣，是構成人體的重要物質基礎，有助于提高人體免疫力。另外，海鴨蛋中還富含人體必需的18種氨基酸以及鈣、鐵、鋅、碘、鉀、硒等多種對人體有好處的微量元素和維生素A、B、E等數十種維生素。廣西欽州海鴨蛋具有體積較大、蛋殼堅厚、蛋清濃稠，蛋黃比例大、色澤呈橙色、無腥味等特點，已經成為廣西農產品地理標志產品。

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs ）是一類含有兩個或兩個以上苯環結構的持久性有機物，具有持久性、長距離遷移性、親脂性和“三致”（致癌、致畸和致突變)）毒性[1-2]。研究發現，長期接觸PAHs可造成孕婦較高流產率，并可通過母體對嬰兒的生長產生嚴重影響，導致幼兒患病危險性增加。毒理學研究表明，PAHs高暴露可誘發人體肝癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、膀胱癌等，而長期呼吸含PAHs的空氣，飲用或食用含有PAHs的水和食物，則會造成慢性中毒[3]。多環芳烴是重要的環境和食品污染物，它們常常源自于環境，會通過大氣、土壤和地面水等介質轉移至水生生物有機體內，生物體吸收后無法進行有效的代謝，這將影響到水中生物的生長，使得生物體內蓄積不同程度的多環芳烴污染物[4-6]。美國環境保護局（EPA）于20世紀80年代就將16種多環芳烴列入優先控制的有毒有機污染物名單中，但未對該16種多環芳烴的具體限量值作出明確規定[7]。據估計，當累計攝入PAHs量超過80mg時，即可誘發癌癥，聯合國農糧組織（FAO/WHO）對食品中的PAHs類物質每天攝入的總量建議不超過10μg為宜[8-9]。

目前，多環芳烴的測定方法較多[10-18]，但國內外針對海鴨蛋中多環芳烴的研究極少，更多的是研究海鴨蛋的營養價值以及經濟效益[19-20]。根據食物鏈生物富集的特點，海鴨攝取海灘上滯留的受多環芳烴污染的小魚、小蝦、小蟹、小螺等水中生物后孵下海鴨蛋，人們食用海鴨蛋隨著攝入量的增加，多環芳烴在人體內不斷富集，其在人體內的濃度必定會逐漸增加，長此以往必定會對人體產生不同程度的危害。本文以犀牛角鎮海鴨蛋和種類繁多的欽州城東市場的海鴨蛋為研究對象，采用色譜法進行前處理和儀器分析，研究其中PAHs的含量，為海鴨蛋食用價值的開發與利用提供依據，對海鴨蛋中多環芳烴的的檢測具有重要的意義，也為同類物質中多環芳烴的檢測提供參考依據。

1 實驗儀器與試劑

GCMS-QP2010Ultra型氣相色譜-質譜聯用儀；LP Vortex Mixer渦旋振蕩器；DS-7510TDH 超聲波清洗器；HH-S6數顯恒溫水浴鍋；ATY124 電子天平；13種PAH標準品（純度均≥99%，美國accustandard公司）)，包括萘（Nap）、苊烯（Acel）、苊（Ace）、菲（Phe）、 蒽（An）、 芘（Py）、?（Chry）、苯并［a］蒽（BaA）、苯并［b］熒蒽（BbF）、苯并［k］熒蒽（BkF）、苯并［a］芘（BaP）、二苯并［a，h］蒽（DahA）、苯并［g，h，i］苝（BghiP）。其他有機試劑均為色譜純級別。

混合標準儲備溶液：1000μg/mL，使用時用正己烷稀釋至所需質量濃度。

2 實驗方法

2.1 樣品的采集

在欽州城東市場及犀牛角鎮一帶養殖戶隨機選取大小相近的海鴨蛋作為實驗對象。用蒸餾水洗凈蛋殼表面，晾干，把海鴨蛋分成蛋殼蛋白蛋黃三部分，置于干凈燒杯中。

表1 13種多環芳烴的回歸方程及相關系數、檢出限

2.2 樣品中多環芳烴的提取

分別稱取5.0g海鴨蛋的蛋殼、蛋白、蛋黃于小燒杯中，轉移至圓底燒瓶，以少量的甲醇沖洗小燒杯內壁，并將沖洗液轉移至圓底燒瓶。采用蛇形冷凝管安裝回流冷凝裝置。再往圓底燒瓶中加入25mL的甲醇和10mL的25%的氫氧化鉀溶液，利用回流冷凝裝置在80℃水浴鍋中浸提60min。浸提結束，再以2～3mL環己烷潤洗蛇形冷凝管內壁，使得環己烷流入圓底燒瓶中，取出，待冷卻至室溫。加入30mL環己烷，振蕩1 min。放入超聲波清洗器中，設置溫度為20℃，超聲提取1 h。取出圓底燒瓶，待冷卻至常溫，用漏斗過濾至分液漏斗中。充分振搖分液漏斗，靜置，直到出現明顯分層，將下層水相轉移到另一個分液漏斗中并加入10mL環己烷，振搖數十下，待到分層，再棄下層水相，合并上層環己烷。加入10.0g無水硫酸鈉，振搖，放置3～4h使其充分脫水，再過濾至旋蒸瓶中。采用旋轉蒸發儀在水浴溫度為40℃的條件下濃縮提取物至體積約1mL。用吸管吸取提取液轉移至硅膠固相萃取柱，進行凈化。

2.3 樣品中多環芳烴的凈化

稱取10.0 g的有活性的二氧化硅，加入適量的環己烷使其濕潤，轉移至填充柱。用30 mL環己烷洗滌柱子，以燒杯收集洗滌液。吸取洗滌液重復沖洗填充柱內壁上的二氧化硅使其沉降，使環己烷液面略高于填充柱內填充物的高度。完成二氧化硅凝膠柱的制備后，將濃縮好的提取物轉移至柱子中，以8 mL體積的環己烷：二氯甲烷=3∶1的混合溶液沖洗柱子，進行洗脫。收集得到經凈化的提取液，用旋轉蒸發儀濃縮近干，加入少量正己烷溶解，轉移至25mL的棕色容量瓶中，以正己烷定容，待GC/MS分析。

2.4 標準溶液的配制

圖1 13種PAHs的質譜圖

濃度為10.0μg/mL的混合標準溶液：準確稱取13種標準品適量，用正己烷溶解并稀釋至刻度線得到單標儲備液。量取適量各單標儲備液轉移至100mL 容量瓶中，以正己烷定容，得到混合標準溶液。其中各PAH 濃度均為10.0 μg/mL，置于冰箱4 ℃保存。

分別取0.0 、0.25、0.5、1.0、2.0mL的濃度為10.0 μg/mL的混合標準溶液置于不同的25mL容量瓶中，以正己烷定容得濃度為0.0、0.1、0.2 、0.4 、0.8 μg/mL的混合標準溶液。

2.5 儀器工作條件

色譜柱：DB- 5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；進樣口溫度：300 ℃；溫度（程序升溫）：初溫60 ℃，保持1min，升溫速度20 ℃/min，至220 ℃，保持1min，升溫速度5 ℃/min，至280 ℃，保持10min。

進樣：不分流進樣1.0 μl。接口溫度：300 ℃。載氣：氦氣。流速：1.0mL/min。掃描方式：SIM掃描。電子能量：70eV。離子源：EI源。離子源溫度 ：230 ℃。劑延遲時間：5min。

3 結果與討論

3.1 標準曲線的測定結果

以標準溶液為母液制備濃度為0.0、0.1、0.2、0.4、0.8μg/mL混合標準溶液，采用氣質聯用儀進行測定，得到13種PAHs的質譜圖，各化合物色譜圖如圖1所示。各多環芳烴回歸方程及線性相關系數見表1，多環芳烴在0～0.8μg/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數在0.991～0.999，方法檢出限在2.50～12.15ng/L。

3.2 回收率試驗

準確量取0.1mL（添加濃度為0.2μg/g）10.0μg/mL的13種PAHs混合標準溶液，按（2.2-2.3）步驟操作及相同條件（2.5）下測定，進行加標回收率試驗。

樣品加標回收：準確稱取5.0g的3份樣品，采用添加標準樣法測定回收率，對樣品提取前加入10.0μg/mL的標準溶液，加標體積為分別為0.1mL（添加濃度為0.2μg/g），按（2.2-2.3）步驟操作及相同條件（2.5）下測定，測定3次。對照組就是未添加標準物的樣品，根據加標的量與對照組的檢出量計算回收率。計算公式：回收率=（加標測得量-樣品原有值）/加入量×100%。結果:13種多環芳烴的空白加標回收率為91.5%～101.3%，樣品加標回收率為90.2%～102.4%。空白、樣品加標回收率實驗結果見表2。結果表明，該方法下PAHs回收率良好，均達到要求。

表2 空白、樣品加標回收率實驗結果

圖2 海鴨蛋中13種PAH的含量圖

3.3 精密度實驗

精確量取10.0μg/mL混合對照品溶液配制成1μg/L混合標液，連續進樣5次，每次進樣量為1μL，計算各峰面積的RSD值，結果見表3。由實驗結果知道各PAHs的精密度RSD為1.9%～5.7%，表明該方法下儀器的精密度好。

3.4 海鴨蛋中PAHs的含量

根據2.2-2.3實驗得到的樣品進行氣質聯用儀測定，得到各樣品的PAHs含量結果見表4，各PAHs含量如圖2所示。

由海鴨蛋中PAHs含量的測定結果可以看出，城東市場這組的海鴨蛋中PAHs總含量較低，為0.42μg/g，平均值為0.032μg/g。各PAH的總含量范圍為0.010～0.090μg/g，最小值為菲、蒽、芘、苯并[g,h,i]苝，最大值為苯并［a］蒽。犀牛角鎮組的海鴨蛋中PAHs總含量較高，為0.995μg/g，平均值為0.077μg/g。各PAH的總含量范圍在0.015～0.155μg/g，最小值為蒽，最大值為?。除了海鴨蛋蛋殼樣品，同一種PAH在相同樣品中的含量相差不大，都是犀牛角鎮的樣品PAHs值較城東市場的值大。將海鴨蛋的三個樣品部分分別進行對比，PAHs總含量最高的是犀牛角鎮海鴨蛋的蛋殼部分，總含量為0.52 μg/g。城東市場組的蛋黃中PAHs的總含量為0.22 μg/g，平均含量為0.017 μg/g，蛋白中PAHs的總含量為0.2 μg/g，平均含量為0.015 μg/g，即食用部分（包括蛋白跟蛋黃）總含量為0.42 μg/g，平均含量為0.016 μg/g。犀牛角鎮組的蛋黃中PAHs的總含量為0.255 μg/g，平均含量為0.019 μg/g，蛋白中PAHs的總含量為0.22 μg/g，平均含量為0.017 μg/g，即食用部分（包括蛋白跟蛋黃）總含量為0.475 μg/g，平均含量為0.018 μg/g。

犀牛角鎮的PAHs含量大于城東市場的PAHs含量，主要是因為犀牛角鎮三面環海，是一座濱海城鎮。東臨大風江，西、南面臨南海欽州灣。沿海有三娘灣、三墩漁場，以海水捕撈為主大力發展漁業。相鄰沿海區域有相應規模的港口碼頭，有機動、非機動漁船等。小鎮附近有少量工業存在，且人口聚集，人類生活污水排放。犀牛角鎮上的居民將海鴨于沿海紅樹林放養，產出的海鴨蛋就很容易遭受海洋傾廢、港口污染（港口碼頭作業的石油類排放）等，造成不同程度的PAHs蓄積。

表3 精密度實驗結果

表4 海鴨蛋中PAHs含量表

根據多環芳烴的環數，可將13種PAHs 按照環數將其分為2-3 環(萘、苊烯、苊、菲、蒽) ，4環(芘、苯并［a］蒽、?) ，5-6 環(苯并［b］熒蒽、苯并［k］熒蒽、苯并［a］芘、二苯并［a，h］蒽、苯并［g，h，i］苝) 。從整體上看，本文采樣點的海鴨蛋無論蛋黃還是蛋殼、蛋白樣品部分，高環數（4-6環）的PAH含量普遍比低環數（2-3環）的PAH含量高，所占總PAHs的比重較大，表明海鴨蛋中PAH主要以高環為主。可能原因是高環數（4-6環）的PAH的辛醇－水分配系數比低環數（2-3環）的PAH大，高環數（4-6環）的PAH更易富集于海鴨蛋中。

4 結論

本文建立了利用氣相色譜質譜聯用儀檢測海鴨蛋中13種多環芳烴含量的實驗方法。對樣品萃取前先進行皂化處理，采用超聲波萃取，使用硅膠固相萃取進行凈化，能去除大部分干擾物質，大大減低假陽性的機率，進而提純樣品中的目標物質多環芳烴。13種多環芳烴在0.0～0.8μg/mL范圍內呈良好的的線性關系，相關系數在0.991～0.999。空白加標回收率為91.5%～101.3%，樣品加標回收率為90.2%～102.4%，精密度RSD分別為1.9%～5.7%，方法檢出限在2.50～12.15 ng/L之間。本方法精密度良好，檢測結果可靠。

該方法下測定的城東市場的海鴨蛋中PAHs總含量較低，為0.42μg/g，平 均 值 為0.032μg/g， 各PAH的總含量范圍是 0.010～0.090μg/g；犀牛角鎮的海鴨蛋中PAHs總含量較高，為0.995μg/g，平均值為0.077μg/g，各PAH的總含量范圍是0.015～0.155μg/g。同一種PAH在相同樣品中的含量相差不大，但犀牛角鎮的PAHs含量普遍大于城東市場的PAHs含量，且兩處采樣點海鴨蛋中高環數（4-6環）的PAH含量普遍比低環數（2-3環）的PAH含量高。

本實驗方法簡單，提取效率高、靈敏度高、重復性好，能準確有效地同時檢測出多種多環芳烴，對海鴨蛋中多環芳烴的的檢測具有重要的意義，也為同類物質中多環芳烴的檢測提供有效的參考依據。