牛冠狀病毒核衣殼蛋白原核表達及鑒定

陸亞冬，劉賢俠，陳創(chuàng)夫

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCV)系冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，其感染對象是脊椎動物，常常是引起10日齡以下初生犢牛腹瀉，由牛冠狀病毒引起的牛冠狀病毒病，是一種以胃腸炎為主要癥狀的，高度接觸性傳染病，經(jīng)口感染為主，其傳染源主要是腹瀉犢牛的糞便被健康犢牛舔食，引起初生犢牛腹瀉，治愈率低，目前尚無有效的治療藥物和疫苗，對小腸絨毛上皮的損害十分嚴重[1]，抗原性方面牛冠狀病毒和其他冠狀病毒之間具有部分交叉性。冠狀病毒很容易產(chǎn)生變異，自身不穩(wěn)定，診斷和預防該病很困難。【前人研究進展】目前尚無有效的治療藥物和疫苗，牛冠狀病毒對小腸絨毛上皮的損害十分嚴重[1]，抗原性方面牛冠狀病毒和其他冠狀病毒之間具有部分交叉性。冠狀病毒很容易產(chǎn)生變異，自身不穩(wěn)定，診斷和預防該病很困難。目前常規(guī)檢測方法不適合臨床的大規(guī)模應用，費用高。【本研究切入點】應用PCR和ELISA方法對新疆部分地區(qū)規(guī)模化牛場進行致犢牛腹瀉冠狀病毒病的初步調(diào)查，應用原核表達蛋白純化技術(shù)對牛冠狀病毒核衣殼蛋白進行初步研究，核衣殼蛋白是牛冠狀病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，常作為檢測抗原，在病毒侵染宿主方面起著扮演著重要的角色，可作為診斷牛冠狀病毒病的候選蛋白。【擬解決的關(guān)鍵問題】牛冠狀病毒N 基因表達的N蛋白比較保守，既可以作為冠狀病毒病的診斷方面用的抗原，又具有很強的免疫原性[2]。研究建立一種快速診斷的試劑盒或試紙條奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

E.coliDH 5α菌株、BL21(DE3)菌株和原核表達載體PET-28a、PET-32a菌株均由石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室保存；PMD19-T載體購自寶生物(大連)公司。

牛冠狀狀病毒陽性病料采自新疆部分規(guī)模化牛場；IPTG購自MerK公司；限制性內(nèi)切酶(EcoRI/HindIII)、T4連接酶、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、HRP標記的山羊抗牛IgG、廣譜彩虹預染Marker，His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)，His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)購自北京康為世紀生物科技有限責任公司；牛冠狀病毒標準陽性血清購自青島瑞爾公司；牛冠狀病毒陽性血清采集自新疆北疆地區(qū)部分發(fā)病犢牛規(guī)模化場，經(jīng)牛冠狀病毒抗原檢測ELISA試劑盒鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計及合成

采集石河子周邊、沙灣、奎屯等部分地區(qū)規(guī)模化牛場腹瀉犢牛糞便樣品141份，健康犢牛糞便若干份。所采集的腹瀉犢牛病程大多在10日齡以內(nèi)。根據(jù)GenBanK中(登錄號：318090.1)Mebus株N基因保守序列設(shè)計3對特異性引物，擴增牛冠狀病毒部分基因的引物，同時設(shè)計引物進行原核表達，上游引物含有EcoRΙ位點，下游引物含有HindⅢ位點，引物由上海生物工程股份有限公司合成。表1，表2

表1 牛冠狀病毒部分基因引物信息

Table 1 Partial gene primer information of bovine coronavirus

名稱Name引物序列(5’-3’)Primer sequence (5 '-3')擴增大小Amplification size (bp)退火溫度TmBCV-N-F1CGGGATCCATGTCTTTTACTCCTGGTBCV-N-F2CCGCTCGAGTTATATTTCTGAGGTGT1 34758℃BCV FATACCCCGGCTGACATTCTCGBCV RCTCTTCTGGCGGGGCTTATTCA 35555℃

表2 PCR引物序列

Table 2 Nucleotide sequences of PCR primers

引物名稱Primer name序列(5’-3’)Sequence (5 '-3')擴增長度Amplification length (bp)退火溫度TmBCV -N-FCGAATTCATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCABCV -N-RCCAAGCTTTTATATTTCTGAGGTATCTTCAGTAAAGG1 40058℃

1.2.2 牛冠狀病毒抗原ELISA檢測

(1)試劑準備：按照說明書操作，使用前所有試劑恢復至室溫。

(2)操作步驟：按照牛冠狀病毒抗原ELISA說明書進行，試劑盒原理是雙抗體夾心法，將處理好的樣品上清液吸取200 μL加入已經(jīng)預先包被牛冠狀病毒捕獲抗體的微孔中，同時設(shè)置陰陽性對照孔和空白孔，除空白孔外，樣品孔中加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，微量震蕩儀器上進行震蕩混勻，用封板膜封好后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中作用1 h，取出棄掉微孔中的液體，每孔用洗滌液洗板5次，每次2 min，加入底物后避光孵育15 min，用終止液進行終止，在450 nm的酶標儀上進行讀數(shù)。

1.2.3 牛冠狀病毒 N基因的擴增、克隆、測序及鑒定

用Trizol法提取牛冠狀病毒病料的RNA，以此為模板進行PCR反應。采用25 μL反應體系：ddH2O 9.7 μL、上下游引物各0.4 μL、模板2.0、2×EsTaqMasterMiX 12.5 μL空白對照：模板改為水。反應條件：預變性95℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，重復30個循環(huán)，再延伸 72℃ 10 min，4℃保存。擴增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收。將N基因PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞。篩選陽性克隆，小提質(zhì)粒并進行EcoRΙ/HindⅢ雙酶切，獲得目的基因片段，切割膠回收N DNA片段和PET-28a和PET-32a酶切產(chǎn)物。將回收的N基因片段與表達載體PET-28a和PET-32a于16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，涂于培養(yǎng)基板上，37℃過夜培養(yǎng)16～18 h，選取生長良好的轉(zhuǎn)化菌落，進行篩選后提取PET -28a-N質(zhì)粒和PET-32a-N質(zhì)粒，并將篩選后經(jīng)雙酶切鑒定目的條帶正確的質(zhì)粒送上海生物工程股份有限公司進行測序，并將測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行在線比對，并將其轉(zhuǎn)化入BL(DE3)感受態(tài)細胞，涂于含有卡那霉素(PET-28a-N)的培養(yǎng)基板上和氨芐霉素(PET-32a-N)的培養(yǎng)板上。37℃過夜培養(yǎng)16～18 h，選取生長良好的轉(zhuǎn)化菌落，進行篩選。經(jīng)酶切鑒定后重組表達載體命名為PET-28a-N和PET-32a-N。

1.2.4 牛冠狀病毒 N基因在大腸桿菌中的誘導表達

將陽性克隆菌接種到含有抗性(100 mg/L)LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min搖菌過夜。吸取200 μL菌液接種到20 mL含有抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液旺盛期，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導表達，分別于2、4、6、8 h取樣。同時設(shè)空載體和未加IPTG誘導的重組菌作為對照。

1.2.5 重組蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3的上清/包涵體鑒定及純化

經(jīng)SDS-PAGE鑒定條帶正確的重組蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3，分別用2 L的三角瓶進行批量誘導后進行收菌，加入適量的裂解液進行過夜裂解，裂解菌體之后，取1 mL菌液分裝到1.5 mL離心管中， 8 000 r/m離心30 min，分別取上清和沉淀，進行15%SDS-PAGE進行電泳，鑒定上清和沉淀。重組蛋白的純化采用His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)、His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)主要操作步驟：

緩沖液的準備

包涵體蛋白純化緩沖液配方。表3

表3 包涵體蛋白純化緩沖液配方

Table 3 Formulation of inclusion body protein purification buffer

組分ComponentTris-HCl(pH7.9)ImidazoleNaClUreaBinding Buffer20 mM5 mM0.5M8MElution Buffer20 mM500 mM0.5M8M

組裝層析柱，將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 min，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出．向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用8倍柱體積的 Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。包涵體蛋白的純化，收集菌體后，每100 mg菌體(濕重)加入2 mL 8 M尿素進行變性，過夜裂解，超聲裂解菌體。10 000×g，4℃離心15 min，分離上清和沉淀，并收集沉淀，將沉淀重懸于Binding Buffer中，盡量混勻使包涵體充分溶解。10 000×g離心20 min，收集上清。將離心后的上清以孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。將上清負載上柱，流速為10倍柱體積/h，收集流穿液。使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用適量Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。洗脫后，依次使用5倍柱體積的Binding Buffer，5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒)，封柱后2～8℃保存。

包涵體形式得到的蛋白需要進行復性即在8M尿素變性后得到的變性條件下目的蛋白需要復性，將目的蛋白放到透析帶中，進行梯度透析分別是6M尿素透析、4M尿素透析、2M尿素透析、1M尿素透析和去離子水透析，時間分別是6～8 h，最后用蔗糖吸干，分裝保存。

His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)主要操作步驟。表4

表4 可溶性蛋白純化緩沖液配方

Table 4 Formula for soluble protein purification buffer

組分ComponentTris-HCl(pH7.9)ImidazoleNaClBinding Buffer20 mM10 mM0.5MElution Buffer20 mM500 mM0.5M

組裝層析柱：將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 min，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。填料的上層是乙醇保護層，將填料和乙醇一起混勻，以1 mL填料純化20～30 mg His標簽蛋白計算，取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。如果乙醇不流出，可以給柱子一個外力，用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。可溶性蛋白的純化，收集菌體后，每100 mg菌體濕重加入1～5 mL細菌裂解液，每1 mL細菌抽提試劑中已加入10 μL蛋白酶抑制劑混合物，超聲裂解菌體。超聲過程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實驗中自己摸索，應避免連續(xù)超聲導致的大量產(chǎn)熱，可分成短時間，多次超聲，通過一定的間隔時間避免溶液過熱。最終菌液變清即可，10 000 r/m，4℃離心3 min，收集上清中的可溶性蛋白。用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負載上柱，流速為10倍柱體積/h，收集流穿液。使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡乙醇要將填料浸沒，封柱后2～8℃保存。

可溶性蛋白和包涵體蛋白純化方式主要是確定Bingding Buffer(組分Tris-HCl、immdazol、NaCl)和Elution Buffer(組分Tris-HCl、immdazol、NaCl)的中的咪唑的濃度，使用梯度咪唑濃度洗脫蛋白，通過SDS-PAGE和Western Blot檢測目的蛋白的純度和活性。

1.2.6 重組蛋白BCV-28a-N-DE3和BCV-32a-N-DE3的Western blot分析

將收集的菌液，10 000 r/min離心1 min 后棄去上清，加入20 μL 5×上樣緩沖液和80 μL去離子水懸浮菌體煮沸10 min，進行SDS- PAGE電泳。用考馬斯亮藍染色鑒定牛冠狀病毒N蛋白的表達。使用半干式轉(zhuǎn)膜儀，將SDS-PAGE凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)印到0.45 μm NC 膜上(300 mA，50 min)，用Western blot膜封閉液封閉1 h,TBST洗滌3次，每次5 min，加入稀釋的牛冠狀病毒陽性血清，37℃孵育2 h,TBST 洗滌3～5次，每次5～10 min，加入1∶4 900稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗牛IgG，孵育2 h，TBST洗滌3～5次，每次5～10 min ，加入DAB顯色液進行顯色反應，于顯色完成后用水終止。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測牛冠狀病毒

應用PCR方法對新疆部分地區(qū)主要規(guī)模化牛場腹瀉犢牛糞便樣品141份，陽性份數(shù)87份，總陽性率：61.7%，擴增出預期的目的片段大小，進行測序，測序結(jié)果顯示N基因的序列與標準序列同源性達到98.22%，同源性較高，說明檢測的犢牛樣品中含有冠狀病毒。

牛冠狀病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因是N基因，N基因高度保守,可作為診斷BCV的候選基因。PCR檢測結(jié)果表明新疆部分地區(qū)腹瀉犢牛遭受冠狀病毒感染。圖1，圖2，表5

表5 新疆部分地區(qū)主要規(guī)模化牛場腹瀉犢牛糞便樣品RT-PCR陽性檢測結(jié)果

Table 5 The main part of Xinjiang area scale test results positive fecal samples of RT-PCR cattle calf diarrhea

主要規(guī)模化牛場Major scale cattle farm樣品總數(shù)Number of samples陽性份數(shù)Positive number陽性率Positive rate (%)石河子某A規(guī)模化牛場12650.00沙灣縣某A規(guī)模化奶牛場111090.90沙灣某B規(guī)模化牛場16743.75沙灣某C規(guī)模化牛場10550.00奎屯某A規(guī)模化牛場232295.65奎屯某B規(guī)模化牛場8675.00奎屯某C規(guī)模化牛場8450.00奎屯某D規(guī)模化牛場9888.88奎屯某E規(guī)模化牛場11545.45奎屯某F規(guī)模化牛場1218.30奎屯某G規(guī)模化牛場11763.63沙灣某B規(guī)模化牛場10660.00總計1418761.70

注：*上述健康犢牛血清采集石河子某試驗站

Note：

注：M:Maker；12：陰性對照；1～4、8未擴增出牛冠狀病毒基因；5～7、9～11：牛冠狀病毒N基因克隆產(chǎn)物

Note： M:Maker; 12: negative control; 1-4 and 8 did not amplify the coronavirus gene; 5-7, 9-11: Bovine coronavirus N gene clone product

圖1 某A規(guī)模化牛場腹瀉犢牛糞便冠狀病毒基因擴增

Fig.1 A scale cattle feces of calves diarrhea coronavirus gene amplification detection results

注：M:Maker；19：陰性對照；1～18、20～24：均擴增出牛冠狀病毒N基因部分基因355 bp

Note： M:Maker; 19: Negative control; 1-18, 20-24: All the N genes of bovine coronavirus were amplified by partial 355 bp gene

圖2 某B規(guī)模化牛場牛場腹瀉犢牛糞便樣品冠狀病毒基因擴增

Fig.2 B large-scale dairy cattle calves fecal samples of diarrhea coronavirus gene amplification detection results

2.2 ELISA檢測

(1)檢測新疆部分地區(qū)主要規(guī)模化牛場腹瀉犢牛樣品 141份，陽性數(shù)99份，陽性率70.21%。表6

2.3 牛冠狀病毒N基因的擴增

用BCV- N-F/BCV- N-R引物擴增N基因，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到約1 400 bp條帶，與預期結(jié)果相符。圖3

表6 新疆部分地區(qū)主要規(guī)模化牛場腹瀉犢牛糞便樣品雙抗體夾心法ELISA陽性檢測

Table 6 The main part of the Xinjiang scale of dairy calves diarrhea stool samples of double antibody sandwich ELISA positive test results

主要規(guī)模化牛場Major scale cattle farm樣品數(shù)Number of samples陽性數(shù)Positive number陽性率Positive rate (%)石河子某A規(guī)模化牛場121083.33沙灣縣某A規(guī)模化奶牛場11981.81沙灣某B規(guī)模化牛場161487.50沙灣某C規(guī)模化牛場10880.00奎屯某A規(guī)模化牛場232191.30奎屯某B規(guī)模化牛場8225.00奎屯某C規(guī)模化牛場8562.50奎屯某D規(guī)模化牛場9444.00奎屯某E規(guī)模化牛場111090.90奎屯某F規(guī)模化牛場12216.66奎屯某G規(guī)模化牛場11981.00沙灣某B規(guī)模化牛場10550.00總計1419970.21

注：健康犢牛血清采集自石河子某實驗站

注：M:DNA 標準MarKer 5 000;1、3：N基因產(chǎn)物；2：陰性對照

Note： M:DNA standard MarKer 5,000; 1, 3:N gene products; 2: Negative control

圖3 N基因的擴增結(jié)果

Fig.3 The amplification result of N gene

2.4 鑒定重組克隆載體PMD 19-T-N

分別采用雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒PMD19-T-N,用EcoRΙ/HindⅢ酶切片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到約1 400 bp片段和約4 000 bp處可見清晰條帶，與預期結(jié)果一致。圖4

2.5重組原核表達載體PMD19-T-28a-N和PMD19-T-32a-N的雙酶切及測序結(jié)果鑒定

將PMD19-T-28a-N 用EcoRΙ/HindⅢ雙酶切鑒定，以2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果分別在1 400 bp和5 369 bp出可見清晰條帶(圖5)和(圖6)，同時將保守序列測序結(jié)果與牛冠狀病毒N基因標準毒株Mebus株基因序列應用DNAMAN軟件進行在線比對同源性達到98.22%(部分測序結(jié)果圖7)。圖5～7

注：M：DNA 標準MarKer 5 000 bp.1、2、3、4、5雙酶切后的目的條帶；6：未進行雙酶切的PMD19-T-N質(zhì)粒

Note： M:DNA MarKer 5,000 bp.1, 2, 3, 4, 5 after double digestion to strip; 6: NO PMD19-T-N plasmid double digestion

圖4 PMD19-T-N 酶切鑒定結(jié)果

Fig.4 Enzyme digestion of PMD19-T -N

2.6 目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測

重組菌經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE經(jīng)分析表明，目的蛋白成功表達，重組蛋白相對分子質(zhì)量約為54KD，與理論分析值相符。圖8

2.6.1 重組BCV-N-28a-DE3蛋白上清或包涵體的鑒定(圖9)

注：M：5 000 bp Maker.1、2、3：雙酶切后的目的條帶；4：未進行雙酶切的陰性對照

Note： M:5,000 bp Maker.1, 2, 3: Target bands after double enzyme digestion; 4: Negative control without double enzyme digestion

圖5 PMD19-T-28a-N 酶切鑒定

Fig.5 Enzyme digestion of PMD19-T-28a-N

注：M：5 000 bp Maker.1、2：雙酶切后的目的條帶；3：未進行雙酶切的陰性對照

Note： M:5,000 bp Maker.1, 2: Target bands after double enzyme digestion; 3: Negative control without double enzyme digestion

圖6 PMD19-T-32a-N 酶切鑒定

Fig.6 Enzyme digestion of PMD19-T-32a-N

圖7 牛冠狀病毒N基因保守序列測序結(jié)果部分

Fig.7 Sequence map of N gene of bovine coronavirus

注：M:蛋白分子質(zhì)量標準。1、2、3、4加IPTG誘導的重組菌；5:PMD19-T-28a-N未誘導對照

Note： The molecular weight standard of M: protein. 1, 2, 3, 4 and IPTG induced recombinant bacteria; 5:PMD19-T-28a-N was not induced

圖8 重組蛋白 PMD19-T-28a-DE3-N SDS-PAGE分析

Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant protein of PMD19-T-28a-DE3-NSDS-PAGE

注：2～6為蛋白表達在上清，1、7～9為蛋白表達在包涵體

Note： Description: 2-6 protein was expressed in supernatant, 1 and 7-9 were expressed in inclusion bodies

圖9重組BCV-N-28a-DE3蛋白上清或包涵體的鑒定

Fig.9 Identification of recombinantBCV-N-28a-DE3proteinsupernatantorinclusionbody

2.6.2 BCV-N-32a-DE3蛋白的誘導表達及SDS-PAGE鑒定

對加入誘導劑的菌進行不同時間段收菌，同時設(shè)置未加誘導劑的作為對照，經(jīng)SDS-PAGE進行蛋白表達及表達量的鑒定。圖10

注：M:蛋白分子質(zhì)量標準；1～4:32a-N誘導2、4、6、8 h; 5:32a-N未誘導；6～7:32a-DE3未誘導

Note： M: Protein molecular quality standard; 1-4:32a-N induced 2, 4, 6, and 8h.5:32a-N did not induce; 6-7:32a-DE3 was not induced

圖10 BCV-N-32a-DE3蛋白的誘導表達及SDS-PAGE鑒定

Fig.10InducibleexpressionofBCV-N-32a-DE3proteinandidentificationofSDS-PAGE

2.6.3 BCV-N-32a-DE3蛋白表達的上清或包涵體鑒定(圖11)

注：M:廣譜彩虹預染Maker; 說明：1～7為包涵體表達，9～11為上清表達

Note： M: Broad-spectrum rainbow pre staining Maker; Description: 1-7 For inclusion body expression, 9-11 For supernatant expression

圖11 BCV-N-32a-DE3蛋白表達的上清或包涵體鑒定

Fig.11 Identification of the supernatant or inclusion body of the expressionofBCV-N-32a-DE3protein

2.6.4 BCV-N-28a-DE3表達的蛋白純化結(jié)果

目的蛋白純化后目的蛋白的大小與理論值相符約54 KD。圖12

注：M:廣譜彩虹預染Maker;1：對照；2～4為500 mmoL咪唑洗脫下蛋白純化的結(jié)果

Note： M: Broad-spectrum rainbow pretreated Maker; 1: Contrast; 2-4 purified by 500mmol imidazole eluted protein

圖12重組表達蛋白BCV-N-28a-DE3表達的蛋白純化

Fig.12 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-28a-DE3

2.6.5 BCV-N-32a-DE3表達的蛋白純化結(jié)果

全菌采用50 mM Tris-HCL(pH=7.9)，300 mM NaCl，50 mM Imidazole含1%的TritonX-100，1 mM DTT，1 mMPMSF超聲裂解，同時以50 mM Tris-HCL(pH=7.9)，300 mM NaCl，50 mM Imidazole平衡Ni柱之后用250 mmol、500 mmol咪唑的平衡緩沖液洗脫目的蛋白，并收集每個洗脫組分,整個過程在低溫下操作，進行SDS-PAGE分析檢測。圖13，圖14

注：M：廣譜彩虹預染Marker,2～6為250 mmoL咪唑洗脫下目的蛋白純化的結(jié)果

Note： M: Broad spectrum rainbow pre dye Marker, 2-6 Purified result of 250mmol imidazole eluted target protein

圖13重組表達蛋白BCV-N-32a-DE3表達的蛋白純化

Fig.13 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-32a-DE3

注：M：廣譜彩虹預染Marker，1～4、5～12、17～21為500 mmoL咪唑洗脫下目的蛋白純化的結(jié)果

Note： M: Broad-spectrum rainbow pre dye Marker, 1-4, 5-12, 17-21 for 500mmol imidazole eluted target protein purification results

圖14重組表達蛋白BCV-N-32a-DE3表達的蛋白純化

Fig.14 Protein purification of recombinantexpressionproteinBCV-N-32a-DE3

2.7牛冠狀病毒重組表達BCV-N-28a-DE3和BCV-N-32a-DE3的Western blot鑒定

重組菌表達產(chǎn)物通過Western blot進行分析。其結(jié)果顯示，在54 KD處有明顯條帶，與預期值相符，在70 KD處有明顯條帶，同樣與預期值相符Western blot分析結(jié)果表明，表達的重組N蛋白可以與牛冠狀病毒陽性血清發(fā)生特異性免疫學反應，證實表達的重組N蛋白具有良好的反應原性。圖15，圖16

2.7.1 重組表達 BCV-N-28a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

注：M:蛋白質(zhì)分子標準質(zhì)量 Marker；1、2純化后的PMD19-T-28a-DE3-N 融合蛋白

Note： M: Protein molecular standard mass Marker; 1 and 2 purified PMD19-T-28a-DE3-N fusion protein

圖15 融合蛋白的Western blot分析

Fig.15 Western blot analysis of fusion protein

注：M:蛋白質(zhì)分子標準質(zhì)量 Marker；1～4：純化的重組蛋白N與牛冠狀病毒陽性血清發(fā)生反應(陽性血清濃度：分別是1～2，1:100；3～4,1:50)。5～6：純化的重組蛋白N與牛陰性血清不發(fā)生反應

Note： M: Protein quality standard Marker; 1-4: Recombinant protein N and Bovine coronavirus positive serum purified reaction (positive serum concentration were 1-2, 1:100; 3-4,1:50). 5-6: Purified recombinant protein N did not react with bovine negative serum

圖16 重組表達純化的蛋白BCV-N-28a-DE3Western blot分析

Fig.16 Recombinant expression and purificationofproteinBCV-N-28a-DE3Westernblotanalysis

注：M：蛋白質(zhì)分子標準質(zhì)量；1：純化的重組蛋白N與牛冠狀病毒標準陽性血清發(fā)生反應

Note： M: Protein molecular standard quality; 1: Purified recombinant protein N reacted with bovine coronavirus standard positive sera; Analysis of recombinant expression and purification protein BCV-N-28a-DE3 Western blot

圖17 重組表達純化的蛋白BCV-N-28a-DE3Western blot分析

Fig.17 Recombinant expression andpurificationofproteinBCV-N-28a-DE3Westernblotanalysis

2.7.2 重組表達 BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

注：M：蛋白質(zhì)分子標準質(zhì)量；1～5：重組蛋白N與牛冠狀病毒陽性血清發(fā)生反應

Note： M: Protein molecular standard quality; 1-5: Recombinant protein N reacts with bovine coronavirus positive serum

圖18重組表達BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

Fig.18 Identification of recombinant WesternblotexpressingBCV-N-32a-DE3protein

注：M:蛋白質(zhì)分子標準質(zhì)量 Marker;1～4：重組蛋白與牛冠狀病毒標準陽性血清發(fā)生反應

Note： M: Protein molecular standard mass Marker; 1-4: Recombinant protein and Bovine coronavirus standard positive serum reaction

圖19重組表達BCV-N-32a-DE3蛋白的Western blot的鑒定

Fig.19 Identification of recombinant WesternblotexpressingBCV-N-32a-DE3protein

3 討 論

研究從新疆部分地區(qū)采集規(guī)模化牛場中采集腹瀉犢牛的糞便，對采集的糞便進行恰當?shù)奶幚恚瑧门９跔畈《究乖瓩z測試劑盒檢測新疆部分地區(qū)主要規(guī)模化牛場腹瀉犢牛樣品 141份，陽性數(shù)99份，陽性率70.21%。應用PCR方法對新疆部分地區(qū)主要規(guī)模化牛場腹瀉犢牛糞便樣品141份，陽性份數(shù)87份，總陽性率為61.7%，綜合PCR方法和ELISA方法的檢出結(jié)果感染牛冠狀病毒腹瀉犢牛糞便陽性率在61.7%～70.21%，這與張坤等[8]運用PCR和ELISA方法對新疆北疆部分地區(qū)規(guī)模化牛場冠狀病毒感染率略高，研究對新疆部分地區(qū)規(guī)模化牛場腹瀉犢牛糞便中病原的調(diào)查具有一定的參考意義。

BCV是20世紀70年代初期發(fā)現(xiàn)的導致犢牛腹瀉病毒的主要病原之一，是引起新生犢牛出血性腹瀉,表現(xiàn)為急性大規(guī)模的爆發(fā)與流行，劇烈腹瀉，持續(xù)時間長、犢牛急劇消瘦、排噴射狀的糞便導致脫水嚴重、排黑色糞便中帶血，另有研究表明，犢牛腸道感染和呼吸道感染可能由同一型BCV引起的感染[3、4]。犢牛腹瀉病原有細菌、病毒、寄生蟲等均可導致犢牛腹瀉，給畜牧業(yè)造成了極大的損失。1972年Mebus等[5]在成年牛和犢牛的腹瀉物中通過電鏡法檢出BCV，1985年宋廣林等[6]、1990年姚火春等[7]對于冠狀病毒在我國的存在和流行進行了研究。張坤等[8]進行了牛冠狀病毒的分子流行病學調(diào)查，并繪制了系統(tǒng)發(fā)生樹，對核苷酸同源性的問題作了介紹。

冠狀病毒是目前已知RNA病毒中最大的病毒，使得人和多種動物易于感染，冠狀病毒基因組極易發(fā)生重組，在基因組的結(jié)構(gòu)特征方面牛冠狀病毒呈現(xiàn)遺傳的多樣性。N蛋白構(gòu)成牛冠狀病毒的核衣殼，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的致病性方面有關(guān)。喬軍等[9]研究表明N蛋白其結(jié)構(gòu)蛋白中保守性很高的蛋白，發(fā)現(xiàn)其N蛋白具有高度螺旋結(jié)構(gòu)，與Motokawa等[10]的研究一致。為了證明N蛋白在復制、翻譯、致病性等方面起作用，基于體外的復制實驗，從RNA復制、加工中發(fā)現(xiàn)牛傳染性胃腸炎結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白所制備的抗血清，在體外復制實驗時發(fā)現(xiàn)能抑制90%的基因的合成。說明N蛋白在致病性、復制及翻譯過程中起作用。N蛋白發(fā)現(xiàn)牛在感染該病毒早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生抗蛋白的高水平抗體，N蛋白是病毒的主要免疫原蛋白之一，可誘發(fā)機體產(chǎn)生有效的免疫應答。在糖基化修飾，蛋白折疊的影響方面，冠狀病毒N蛋白的主要抗原表位，不受糖基化的修飾，蛋白折疊的影響，可應用常規(guī)的原核表達系統(tǒng)進行表達，而且表達量很高，Seo和Seah等[11-12]、Peng 等[13]等分別對在研究雞傳染性支氣管炎病毒、嵌合小鼠肝炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白時發(fā)現(xiàn)：N蛋白與CTL表位和B細胞表位，病毒的組織嗜性有關(guān)的區(qū)域及抗原位點有關(guān)。冠狀病毒的N蛋白是高度保守、抗原性和免疫原性比較強、N蛋白在BCV不同毒株間變異小并且在病毒RNA的包裝和復制中起重要作用的核衣殼蛋白，在病毒感染中可大量表達，核衣殼蛋白可作為病毒感染的靶抗原，具有重要的意義。由于冠狀病毒核衣殼蛋白N基因序列高度保守，可用于基因分型的鑒定。這與張婉琪等[14]利用同源性分析的研究發(fā)現(xiàn)N蛋白高度保守，而在不同屬冠狀病毒之間保守性很低且不完全一致。

4 結(jié) 論

4.1 應用PCR和ELISA方法對新疆北疆部分地區(qū)規(guī)模化牛場中致犢牛腹瀉主要病原冠狀病毒進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有較高的感染率，對規(guī)模化牛場采取積極的防控提供依據(jù)。所采集141份腹瀉犢牛糞便中，用ELISA檢測陽性率70.21%；再用PCR檢測出陽性率為61.7%。犢牛冠狀病毒是導致石河子、沙灣、奎屯等10個規(guī)模化奶牛場和部分肉牛場犢牛腹瀉的主要病原；ELISA方法和PCR方法結(jié)合應用檢測犢牛冠狀病毒效果具有參考意義。

4.2 在PET-28a和PET-32a原核表達系統(tǒng)中高效表達了BCV N蛋白，并進行了免疫印跡實驗，N蛋白具有很強的免疫反應性。