miR?34a對人結腸癌SW480細胞增殖、凋亡、細胞周期及皮下移植瘤生長的影響

王傳卓 辛鶴 劉波 劉兆玉

中國醫科大學附屬盛京醫院介入科（沈陽 110004）

結直腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約1 360 000新發患者［1］，發病率和病死率成逐年上升趨勢。結直腸癌治療以手術切除及化療為主，臨床治療策略逐步改善，但5年生存率仍不理想，因此，尋找新的診療靶點及策略顯得尤為重要［2］。

microRNA是一類內源性、短鏈、非編碼RNA，在轉錄后水平調控基因表達，參與眾多生理及病理過程［3］。大量研究［4］表明，幾乎在所有腫瘤都存在miRNA表達異常，miRNA在腫瘤發生及發展的多個環節發揮重要作用。miRNA在結腸癌中的角色越來越受到關注，miR?34a也是其中一員，之前的研究已經證實miR?34a可抑制結腸癌的生長和轉移［5-6］，但同時在細胞和動物實驗中驗證目前國內外少有研究。本研究通過慢病毒轉染技術，在人結腸癌SW480細胞系中過表達miR?34a，研究miR?34a對人結腸癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響；并通過構建裸小鼠皮下移植瘤模型，繪制腫瘤生長曲線，研究miR?34a對結腸癌細胞皮下移植瘤生長的影響，通過細胞實驗聯合動物實驗的方法揭示miR?34a對結腸癌生長的影響，為結腸癌的診療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及倫理本實驗研究已通過中國醫科大學附屬盛京醫院醫學倫理委員會審核。4～6周齡Balb/c?nu裸小鼠20只，雌雄各半，體質量16～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，于SPF環境下飼養。

1.2 細胞培養、轉染及實驗分組人結腸癌SW480細胞（中國科學院上海生命科學院細胞庫）用含10%胎牛血清（Gibco公司）的RPMI1640培養液（Gibco公司）、于37℃、5%CO2培養箱中培養。過表達miR?34a慢病毒和對照組空載慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司包裝合成，目的基因慢病毒載體 GV309，引物序列：5′?GGAAAGGAC?GAAACACCGGATCCTTTCTTTCCTCCCCAC?3′［has?mir?34a（4174?1）?P1］，5′?TGTCTCGAGGTCGAGA?ATTAAAAAACGCAGAAGAGCTTCC?3′［has?mir?34a（4174?1）?P2］；對照組插入序列5′?TTCTCCGAAC?GTGTCACGT?3′。實驗分兩組：miR?34a組（轉染過表達miR?34a的慢病毒載體）和NC組（陰性對照組，轉染空病毒載體）。將SW480細胞以1×105/孔的細胞數接種于6孔板，細胞融合度達20～30%時，以MOI值=20感染SW480細胞，感染72 h后，細胞GFP綠色熒光率達85%以上，收集細胞進行實驗。

1.3 Quantitativereal?timePCR（qRT?PCR）檢測按照TRIzol Regent試劑（Ambion公司）說明書方法提取細胞及移植瘤組織中的總RNA。使用Takara 公司 的 Mir?X miRNA First?Strand Synthesis Kit進行miRNA的反轉錄反應合成cDNA，SYBR Advantage qPCR Premix進行qRT?PCR檢測，以U6為內參。LightCycler480進行PCR擴增，反應條件如下：模板預變性95℃、20 s；PCR反應95℃、5 s，60 ℃、20 s，共40個循環，以2?ΔΔCt法計算 miRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程公司合成，miR?34a上游引物：5′?GGCAGTGTCTTAGCT GGTTG?3′，下游引物試劑盒內提供；U6上游引物：5′?GGAACGATACAGAGAAGATTAGC?3′，下游引物：5′?TGGAACGCTTCACGAATTTGCG?3′。

1.4 細胞增殖實驗按照北京碧云天公司的CCK?8細胞增殖檢測試劑盒說明書步驟操作。收集細胞、調整細胞懸液濃度5×104/mL，于96孔板中接種細胞懸液100μL/孔，37℃連續培養4 d，每天更換培養液。每孔加入10μL CCK?8試劑，培養箱內孵育2 h后，酶標儀測定在450 nm處各孔的吸光值，繪制細胞增殖曲線。

1.5 細胞凋亡檢測按照eBioscience公司的An?nexin V?APC單染法細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟操作。消化、離心、洗滌細胞。200μL 1×binding buffer重懸細胞沉淀，加入10μL Annexin V?APC染色，室溫避光15 min，再加入400 μL 1×binding buf?fer，1 h內上流式細胞儀檢測。

1.6 細胞周期檢測按照凱基生物公司的細胞周期檢測試劑盒說明書步驟操作。收集細胞、調整濃度為1×106/mL，取1 mL單細胞懸液、離心、去上清，加入500μL體積分數為70%的乙醇固定過夜。PBS洗去固定液，加入100μL的RNase A，37℃水浴30 min，再加入400μL的PI染色混勻，4℃避光30 min，流式細胞儀進行檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。

1.7 裸鼠皮下移植瘤模型構建及瘤體測量收集細胞，調整濃度為1×107/mL，1 h內使用。于裸鼠右后肢腹側皮下注射0.2 mL腫瘤細胞懸液，依據注射細胞不同，分為兩組：鼠?miR?34a組和鼠?NC組，每組10只，雌雄各半。術后繼續在SPF條件下飼養，正常飲食，觀察裸鼠皮下成瘤情況，每7天使用游標卡尺測量裸鼠皮下移植瘤長徑（L）及短徑（W），利用公式V=（L×W2）/2計算體積，繪制移植瘤生長曲線。第28天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，電子天平稱重。組織標本于離體30 min內保存，一半置于液氮中凍存，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.8 統計學分析采用SPSS 16.0軟件分析數據，計量資料以均值±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR?34a在各組SW480細胞中的相對表達通過慢病毒介導轉染方法，獲得了穩定高表達miR?34a的SW480細胞株（圖1）。qRT?PCR檢測兩組細胞中miR?34a相對表達量的結果顯示：miR?34a組高于NC組（圖2a，t=-54.190，P＜0.05）。

圖1 慢病毒轉染后的SW480細胞及綠色熒光表達（左側為白光視野，右側為對應熒光視野，×200）Fig.1 SW480 cells transfected with lentivirus were observed with white bright（left）and green fluorescence assay（right）in the same vision using fluorescence microscopy（× 200）

圖2a qRT?PCR檢測兩組細胞中miR?34a的相對表達量Fig.2a The relative expression of miR?34a was detected by qRT?PCRin cells

圖2b qRT?PCR檢測兩組皮下移植瘤中miR?34a的相對表達量Fig.2b The relative expression of miR?34a was detected by qRT?PCRin xenograft tumors

2.2 miR?34a對SW480細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響CCK?8法檢測各組細胞增殖情況的結果顯示（圖3）：隨著培養時間的延長，miR?34a組細胞增殖能力逐漸低于NC組，培養至第2天時，差異有統計學意義（t=18.832，P＜0.05）。流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況的結果顯示（圖4）：miR?34a組的凋亡率（10.44±0.29）%明顯高于NC組（3.93±0.06）%，差異有統計學意義（t=-65.026，P＜0.05）。流式細胞儀檢測各組細胞周期的結果顯示（圖5）：miR?34a組細胞G0/G1期為（48.81±0.64）%，低于NC組（52.48±0.64）%，差異有統計學意義（t=12.125，P＜0.05）；miR?34a組細胞S期為（16.51±0.36）%，低于NC組（21.39±0.38）%，差異有統計學意義（t=28.035，P＜0.05）；miR?34a組細胞G2/M期分別為（34.68±0.67）%，高于NC組（26.02±0.42）%，差異有統計學意義（t=-32.989，P＜0.05）。上述實驗結果表明：miR?34a可抑制人結腸癌SW480細胞增殖、促進凋亡，誘導細胞周期出現G2/M期阻滯。

圖3 CCK?8檢測miR?34a對結腸癌SW480增殖能力的影響Fig.3 CCK?8 method to detect the effect of miR?34a on SW480 cells proliferation

圖4 單染法、流式細胞儀檢測細胞凋亡結果：右上象限與右下象限之和代表凋亡細胞所占百分比，miR?34a組的凋亡率高于NC組Fig.4 Single staining and flow cytometry were used to detect apoptosis：the sum of right upper and right lower quadrant represents the percentage of apoptotic cells and the apoptotic rate of miR?34a group was higher than that of NCgroup

2.3 miR?34a對裸鼠皮下移植瘤生長的影響皮下移植瘤生長曲線結果顯示（圖6），鼠?miR?34a組腫瘤生長速度慢于鼠?NC組，在接種細胞14 d后差異有統計學意義（t=3.029，P＜0.05）。鼠?miR?34a組移植瘤最終體積和重量分別為（207.59±34.49）mm3和（199.64±35.28）mg，均低于鼠?NC組（272.53±31.72）mm3和（260.72 ± 43.09）mg（t=4.383，P＜0.05和t=3.469，P＜0.05）。qRT?PCR檢測兩組移植瘤中miR?34a相對表達量的結果顯示：鼠?miR?34a組高于鼠?NC組（圖2b，t=-55.474，P＜0.05）。上述結果表明：miR?34a可抑制裸鼠皮下移植瘤生長。

圖5 流式細胞儀檢測細胞周期結果：miR?34a組的第二峰（G2/M期）高于NC組Fig.5 Flow cytometry results in cell cycle：the second peak in the miR?34a group（G2/M phase）was higher than the NC group

圖6 裸鼠皮下移植瘤生長曲線Fig.6 Growth cruve of subcutaneously xenograft tumors

3 討論

miRNA是一類普遍存在于真核生物中、高度保守的非編碼RNA分子，由18～25個核苷酸組成，可通過與下游靶基因mRNA的3′UTR區序列互補結合，引起靶基因降解或抑制翻譯［7-8］。人miR?34a定位于染色體1q36.22，是一段比較脆弱的區域，在宮頸癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、結腸癌等多種惡性腫瘤組織中發現miR?34a表達下降，其表達水平與惡性腫瘤的臨床分期、腫瘤復發相關［9-11］。研究表明［12］，miR?34a與經典抑癌基因p53關系密切，p53可使miR?34a的CpG島啟動子區域去甲基化，誘導miR?34a表達，進而調控miR?34a下游靶基因。但p53對miR?34a功能并非必須，在缺乏內源性p53的情況下，miR?34a仍能抑制腫瘤細胞的生長。

腫瘤細胞的增殖能力是影響腫瘤進展的重要因素，且與細胞凋亡和細胞周期密切相關。研究［13-14］報道，miR?34a可靶向調節 PDGFRA、PAR2等基因，進而抑制結腸癌細胞增殖。本研究通過CCK?8法測定miR?34a組細胞增殖能力低于NC組，培養至第72、96 h時的差異有統計學意義（P＜0.05），證實了miR?34a可抑制人結腸癌SW480細胞增殖。凋亡是細胞程序性死亡過程，異常凋亡可導致多種疾病發生。細胞的凋亡受細胞凋亡基因嚴格調控，miR?34a對凋亡影響主要通過p53相關通路實現，參與p53下游的調控通路，抑制抗凋亡基因Bcl?2的表達，凋亡細胞比例增多，可有效抑制細胞增殖速率［15］，Bcl?2信號通路在細胞增殖與凋亡過程中發揮重要作用。本研究中miR?34a組的凋亡率明顯高于對照組，表明miR?34a可誘導人結腸癌SW480細胞凋亡，從而抑制其增殖速率，在結腸癌的發生、發展中發揮“抑癌基因”作用。惡性腫瘤最基本的生物學特征之一是細胞周期調控紊亂導致的細胞惡性轉化和腫瘤細胞失控性增殖，細胞周期依賴激酶（CDKs）和細胞周期蛋白（Cyclin）在G1期向S期過渡及G2期向M期過渡過程中發揮重要作用［15］。本研究通過外源性過表達miR?34a，使人結腸癌SW480細胞G2/M期明顯高于對照組，說明過表達miR?34a可以誘導細胞周期出現G2/M期停滯，達到抑制細胞增殖、促進衰老作用。上述實驗結果證實了，在體外條件下過表達miR?34a可抑制結腸癌SW480細胞增殖，增殖能力的降低可能通過誘導凋亡和細胞周期阻滯得以實現。miRNA可以通過多條信號通路影響下游靶基因，進而改變細胞的生物學功能。本研究不足之處是缺少miR?34a的作用機制研究，雙熒光素酶報告基因檢測是研究miRNA目的基因的經典方法，進一步檢測miR?34a下游的目的基因、闡明其作用機制是我們下一步的研究方向。

臨床實踐證實，腫瘤體積是制約腫瘤根治手術的關鍵因素之一，高腫瘤負荷使腫瘤更易發生轉移，故縮小腫瘤體積對根治腫瘤、延緩腫瘤進展具有重要意義。生物體內環境與外環境存在差異，體外實驗的結果可能與動物實驗存在差異，我們通過種植裸鼠皮下瘤、繪制瘤體生長曲線及稱量瘤體最終重量的方法，進一步證實miR?34a在體內環境對結腸癌增殖的影響。實驗證實，miR?34a可抑制腫瘤的生長速度及腫瘤的最終重量，提示miR?34a在裸鼠體內仍可發揮“抑癌基因”作用，抑制結腸癌細胞生長，可能成為結腸直腸癌治療新的分子靶點。

綜上所述，miR?34a可抑制人結腸癌SW480細胞的增殖、誘導凋亡、阻滯細胞周期，動物實驗進一步證實miR?34a可抑制裸鼠皮下移植瘤生長，miR?34a可能為結直腸癌的診療提供新的依據和分子靶點。