STAT3對宮頸癌HeLa細胞的增殖、凋亡及自噬的影響

張慧蓉 申東翔 羅敏 李軍鵬 楊耀

1廣州軍區廣州總醫院婦產科（廣州510010）；2廣州中醫藥大學（廣州510006）

宮頸癌是育齡期女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡第2位，且發病率逐年升高及呈年輕化趨勢，藥物和婦科手術治療對腫瘤雖取得一定療效，但中晚期惡性腫瘤普遍預后不良的局面并未改變［1］。近年來對宮頸癌的研究不斷深入，但宮頸癌的具體發病機制仍不明確。因此，目前迫切需要進一步深入探討宮頸癌的具體發病機制，為宮頸癌尤其是晚期及復發性宮頸癌的治療與預后提供新思路。信號轉導和轉錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）是一種重要的調控基因，對宮頸癌細胞具有重要的調控作用，與宮頸癌的復發、淋巴轉移及患者預后等明顯相關，能夠引起細胞自噬調控的異常從而影響腫瘤的進展［2］。同時有大量的研究表明，自噬與宮頸癌細胞的增殖、分化及轉移等有密切聯系［3］。細胞自噬在進化上具有高度保守性，其發生過程受自噬相關基因的調控［4］。

近年來有研究表明STAT3對宮頸癌HeLa細胞的增殖與凋亡具有重大影響，主要發揮促癌基因的作用，促進宮頸癌HeLa細胞的增殖，抑制其凋亡［5-6］。同時研究表明，術后宮頸癌的局部復發、遠處轉移及耐藥性的產生成為宮頸癌治療的難點，自噬在宮頸癌中的研究為宮頸癌的治療提供了新的方向［7］。而STAT3與細胞自噬作為調控宮頸癌細胞生理和病理重要通路，其兩者之間的關系仍未闡明，本文將進一步探討通過調控STAT3基因的活性，觀察其對宮頸癌HeLa細胞的增殖、凋亡及自噬的影響，從而闡明STAT3與自噬之間的調控機制及其對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的作用，將為宮頸癌尤其是晚期及復發性宮頸癌的治療與預后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料宮 頸癌細胞株HeLa由廣州軍區廣州總醫院醫學實驗科保存。STAT3過表達質粒、STAT3低表達質粒及空載體質粒均由廣州復能基因生物公司合成，脂質體Lipfecta mineTM2000（Invitrogen），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12培養基（Gibco），OPTI?MEM 培 養 基（Invitrogen），DMSO（Sigma），CCK?8（日本同仁），雙抗（Hyclone），0.25%胰酶（不含EDTA 和酚紅）（Gibco），0.25%胰酶（含EDTA 和 酚紅）（Gibco），PBS緩沖液（吉諾），Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒（日本同仁），MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa），PrimeScript RT Master Mix Kit（TaKaRa），SYBR Premix EX TaqTMⅡ（TaKaRa），兔抗人STAT3抗體、兔抗人Bcl?2抗體、兔抗人Caspase?3抗體、兔抗人Beclin1抗體、兔抗人LC3?Ⅱ抗體和抗兔抗IgG（Cell Signaling Tech?nology），倒置相差熒光顯微鏡（Olympus），流式細胞儀LSR Ⅱ（BD Bio?science），定量PCR儀（QIA?gen Rotor?Gene?6000 Sequence Detection System）。

1.2 細胞的培養和轉染宮 頸癌HeLa細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養液培養，置于37℃5%CO2恒溫培養箱中，當細胞處于對數生長期時用于實驗。將STAT3過表達質粒、STAT3低表達質粒及空載體質粒分別利用脂質體介導瞬時轉染至宮頸癌HeLa細胞中，具體方法按照Lipfecta mineTM2000轉染試劑盒說明書進行操作。轉染48 h后，于倒置相差熒光顯微鏡下進行觀察和拍照，估算細胞的轉染效率。細胞轉染效率（%）=熒光場紅色熒光細胞數/相同視野明場細胞總數×100%。

1.3 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（qRT?PCR）技術檢測STAT3mRNA的表達H eLa細胞轉染48 h后，用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒分別提取各組細胞的總RNA。以紫外分光光度計A280、A260定量測定，使提取總RNA測量結果純度A280/A260為1.8～2.0，濃度≤500 ng/μL為合格。質量合格的RNA逆轉錄成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行，反應體系為25μL。反應條件：預變性95 ℃ 5 min，94 ℃ 3 0 s，65 ℃ 3 0 s，重復40個循環，融解曲線分析：溫度60～95℃。采用2?ΔΔCT法對數據進行相對定量分析，每個樣品每次含有2個復孔，結果來自3次獨立重復的實驗。

1.4 CCK?8實驗檢測細胞增殖用 含10%FBS的DMEM/F12完全培養液重懸轉染48 h后的HeLa細胞，調整細胞濃度為1×104/mL，取各組細胞懸液按100μL/孔接種于96孔板中培養。將培養板在37℃5%CO2條件下的恒溫培養箱中預培養24 h后，向每孔加10μL CCK?8溶液，移入培養箱中繼續孵育，分別在不同的時間點（1、2.5、4 d）取出培養板，用全自動酶標儀測定每孔的吸光度（OD）值，測定波長450 nm，并繪制細胞增殖曲線。每個樣品每次含有3個復孔，結果來自3次獨立重復的實驗。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率轉 染結束后將各組細胞置于37℃5%CO2恒溫培養箱中繼續培養48 h，用不含EDTA的胰酶消化細胞后，置于離心機中以1 000 r/min 4℃離心5 min收集細胞。嚴格按照Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行避光染色，1 h內通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。細胞總凋亡數=早期凋亡細胞數（Annexin V+/PI-）+晚期凋亡細胞數（Annexin V+/PI+）。

1.6 電鏡觀察各組細胞的凋亡小體及自噬小體轉染結束后將各組細胞置于37℃5%CO2恒溫孵箱中繼續培養48 h，取生長狀態良好的細胞用0.25%胰酶消化后，移入1.5 mL的EP管后置于離心機中以1 000 r/min離心5 min后棄上清液，收集足夠量的細胞并立即加入適量的3.1%戊二醛進行固定，隨后進行緩沖液漂洗、脫水劑梯度脫水、丙酮置換、包埋劑梯度浸透、加熱聚合、萊卡EM UC 7超薄切片儀修快、切片（50～70 nm）、醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液100μL染色（15 min～1 h）、雙蒸水沖洗、檸檬酸鉛100μL染色15 min，日立H?7650透射電鏡觀察各組細胞的凋亡小體及細胞形態。

1.7 蛋白裂解及Westernblot法檢測凋亡相關蛋白 B cl?2 和 C aspase?3 及 自 噬 相 關蛋白 B eclin1 和LC3?Ⅱ的表達收 集細胞，加入RIPA蛋白裂解液冰上裂解，使用BCA試劑盒測量蛋白濃度，進行SDS?PAGE電泳分離，將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，置于封閉液中在室溫下于搖床上封閉2 h，加入相應的一抗，4℃孵育過夜，使用TBST潤洗三次，加入帶有熒光標記的二抗室溫下避光孵育1 h，使用TBST洗膜三次，使用Odyssey?掃描儀進行掃膜，運用Image Studio軟件分析結果。

1.8 統計學方法以 上所有的實驗均重復3次，數據結果用均數±標準誤表示。采用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。多組間比較使用one?way ANOVA bonfferoni correction，post hoc unpaired t stu?dent test，P＜0.05為差異有統計學意義。所有統計學檢驗均使用SPSS22.0進行分析。

2 結果

2.1 瞬時轉染效率利用LipfectamineTM2000將STAT3過表達質粒、STAT3低表達質粒及空載體質粒分別瞬時轉染至宮頸癌HeLa細胞中，48 h后，先在倒置相差熒光顯微鏡的明場下觀察細胞，后在同一視野下轉換成熒光場，可觀察各組帶紅色熒光的細胞數均大于各組細胞總數的90%，提示轉染效率均超過90%（圖1）。為證實各組轉染后HeLa細胞中STAT3的表達水平，在各組細胞轉染48 h后，進一步采用qRT?PCR進行檢測，結果顯示STAT3過表達質粒組STAT3的表達量（7.35±0.56），較其空載體質粒組STAT3的表達量（1.00±0.08）明顯上調，差異具有統計學意義（P＜0.01）；STAT3低表達質粒組STAT3的表達量（0.37±0.05），較其空載體質粒組STAT3的表達量（1.00±0.08）明顯下調，差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖1）。

圖1 轉染后各組細胞中紅色熒光的表達及qRT?PCR檢測轉染后各組細胞STAT3 mRNA水平Fig.1 The expression of red fluorescence and the expression of STAT3 mRNA detected by quantitative RT?PCRin each groups after transfection

2.2 CCK?8檢測STAT3對宮頸癌HeLa細胞增殖能力的影響結果顯示，轉染STAT3過表達質粒48 h后HeLa細胞的增殖活性較其空載體質粒組顯著增強（P＜0.01）；轉染STAT3低表達質粒48 h后，則相反（P＜0.01）。這提示STAT3能顯著提高宮頸癌HeLa細胞的增殖能力（圖2）。

圖2 不同轉染組的宮頸癌HeLa的增殖曲線Fig.2 Proliferation of cell growth curve of each groups after transfection

2.3 流式細胞術檢測STAT3對宮頸癌HeLa細胞凋亡率的影響結果顯示，將上述各組細胞轉染48 h后，轉染STAT3過表達質粒后細胞凋亡率為（8.16±1.25）%，相對于空載體質粒組（14.78±1.85）%，凋亡細胞數的比例顯著下降（P＜0.01）；轉染STAT3低表達質粒后細胞凋亡率為（23.08±0.87）%，相對于空載體質粒組（14.78±1.85）%，凋亡細胞數的比例顯著升高（P＜0.01）。這說明STAT3能顯著抑制宮頸癌HeLa細胞的凋亡（圖3）。

圖3 STAT3對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of STAT3 on the apoptosis of cervical cancer HeLa cells

2.4 電鏡觀察各組細胞的凋亡小體及自噬小體各組細胞轉染48 h后，結果顯示：如箭頭所示，STAT3低表達質粒組可見多個凋亡小體及自噬小體，STAT3過表達質粒組未見凋亡小體及自噬小體，對照空載體質粒組可見少量自噬小體。與對照空載體質粒組相比，P＜0.05。

2.5 Westernblot法檢測各組細胞的 B cl?2、Cas?pase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ的表達各 組細胞轉染48 h后，Western blot法檢測結果顯示：與空載體質粒組相比，過表達STAT3質粒組可明顯降低HeLa細胞 C aspase?3、Beclin1 和 L C3?Ⅱ蛋白的表達，增加Bcl?2蛋白的表達（P＜0.01）；而低表達STAT3質粒組，則相反（P＜0.01）。這表明STAT3促進HeLa細胞增殖可能與降低 C aspase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ蛋白表達相關（圖5）。

3 討論

自噬是一種高度保守的細胞降解過程，在正常的生理條件下，自噬起到維持細胞內穩態和調節細胞器更新的作用；為了應對細胞的應激狀態，自噬防止受損的蛋白質和細胞器積累，從而抑制致癌作用［8-12］。自噬在清除有害成分并維持細胞穩態以應對一系列細胞外攻擊時可能會激活其中一個重要的應激反應途徑的下游信號傳導通路，即STAT3信號通路，該通路已涉及自噬過程的多個方面［13］。在宮頸癌發展的各個階段中，STAT3與自噬之間的相互調控是一個復雜的過程，二者之間的不同調控組合對宮頸癌的發展和轉歸都發揮著重要作用。然而，對于二者之間的調控作用與具體機制，目前尚未得出定論。因此，進一步闡明STAT3與自噬之間的調控機制及其對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的影響，將為宮頸癌尤其是晚期及復發性宮頸癌的治療與預后提供新思路。

本研究進一步證實STAT3在宮頸癌中通過調控細胞自噬發揮著類似促癌基因的作用。選取宮頸癌HeLa細胞作為研究對象，通過瞬時轉染，上調或者下調內源性STAT3基因的表達；并通過CCK?8實驗、流式細胞術和電鏡檢測STAT3對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的影響。實驗結果顯示，通過上調STAT3基因能顯著地抑制宮頸癌HeLa細胞發生凋亡，而促進HeLa細胞的增殖能力；通過下調STAT3基因，則相反；表明STAT3類似一種促癌基因發揮作用，促進宮頸癌的進展，與之前的報道相符合［5-6］。

有研究表明，STAT3在腫瘤細胞的自噬中發揮著重要的調控作用［14］，但STAT3在宮頸癌細胞中與自噬的關系及作用機制仍不清楚。大量報道指出Beclin1和LC3?Ⅱ是自噬過程中必不可少的蛋白，高表達的Beclin1能夠減緩腫瘤細胞的生長，抑制細胞周期的進程［15］；在哺乳動物細胞中，抗凋亡蛋白Bcl?2在非饑餓條件下與Beclin1結合并抑制其自噬功能［16］。因此，本研究使用Western blot法檢測 Bcl?2、Caspase?3、Beclin1 和 LC3?Ⅱ的蛋白表達情況。結果顯示，上調STAT3基因后，明顯地抑制HeLa細胞的Caspase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ的蛋白表達，促進Bcl?2的蛋白表達；而下調STAT3基因后，則相反。這提示STAT3對HeLa細胞的增殖和凋亡的影響可能與其調控細胞自噬進而影響Bcl?2、Caspase?3、Beclin1 和 LC3?Ⅱ的蛋白表達有關，但STAT3調控的細胞自噬的信號通路仍不清楚。有研究表明，其中AMPK信號通路是最重要的細胞自噬通路之一，其在刺激因子作用下磷酸化，抑制mTOR，導致LC3?Ⅱ表達增加，引起細胞自噬［17-18］。STAT3在宮頸癌中是否可以直接靶向AMPK，或者通過靶向相關自噬基因從而介導下游的信號通路來調控宮頸癌細胞的自噬，從而影響宮頸癌的發生發展，仍有待進一步深入研究。

圖4 透射電子顯微鏡觀察各組細胞的凋亡小體及自噬小體Fig.4 The apoptotic bodies and autophagosomes of each groups were observed uesed by transmission electron microscope

圖5 Western blot法檢測各組HeLa細胞Bcl?2、Caspase?3、Beclin1和LC3?Ⅱ的蛋白表達Fig.5 The protein expressions of Bcl?2，Caspase?3，Beclin1 and LC3?Ⅱ in each group after transfection detected by Western blot analysis

綜上所述，STAT3能促進人宮頸癌HeLa細胞增殖，抑制其自噬與凋亡，可能與其影響凋亡相關蛋白 Bcl?2和Caspase?3及自噬相關基因Beclin1 和LC3?Ⅱ的蛋白表達有關，但其具體機制仍有待進一步研究。本課題組后續將進一步研究STAT3的下游靶基因和可能作用的信號通路，評估STAT3能否成為針對宮頸癌細胞自噬的基因治療的重要靶點，為晚期及復發性宮頸癌的治療提供新的思路。