β淀粉樣蛋白1?42對滋養細胞遷移和侵襲的影響

廖丹丹 蔡丹純 高云飛 盛超

南方醫科大學南方醫院婦產科（廣州 510515）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種以高血壓和蛋白尿為主要臨床表現、嚴重危害母兒健康的妊娠期特發性疾病。在我國發病率為2%～8%，是圍生期母嬰死亡的主要原因之一［1］。目前主流觀點普遍認為子宮螺旋動脈重鑄障礙導致胎盤形成缺陷是PE發病的始動因素［2-3］，而螺旋動脈血管重鑄障礙的實質是滋養細胞侵襲能力下降［4］。最近蛋白質組學研究發現，包括β淀粉樣蛋白（Aβ 1?42）在內的多種錯誤折疊蛋白異常聚集于PE患者的胎盤絨毛滋養細胞及絨毛間質，提示PE可能是一類蛋白質構象疾病［5］。然而，目前國內外未見β淀粉樣蛋白1?42對滋養細胞遷移和侵襲功能影響的報道。本研究擬利用體外細胞模型，深入探討Aβ1?42對滋養細胞遷移、侵襲的影響及調控機制，為β淀粉樣蛋白在PE的病理發生中所起的作用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料本研究所用的細胞系為永生化的人早孕滋養細胞系HTR?8/SVneo細胞，由加拿大皇后大學Charles H.Graham教授惠贈。主要試劑：Aβ 1?42購自Sigma公司；培養基RPMI 1640和胎牛血清購自GIBCO公司；CCK?8檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；總蛋白提取試劑盒購自普利萊基因技術有限公司；vimentin，N?cad?herin抗體購自Cell Signaling Technology；β?actin抗體購自武漢博士德公司；辣根過氧化物酶IgG購自北京中杉金橋公司；抗 Aβ1?42抗體、MMP?2及MMP?9 ELISA試劑盒購自Abcam；MMP?2/MMP?9活性檢測試劑盒購自AnaSpec。

1.2 實驗方法

1.2.1 Aβ1?42的配制將Aβ1?42凍干粉溶于DMEM培養基，配制成200μmol/L儲備液，置于37℃培養箱孵育7 d，使之老化，過濾分裝，-20℃保存。臨用時以DMEM培養基稀釋到所需濃度。

1.2.2 細胞的培養及分組HTR?8/SVneo細胞系培養于含10%胎牛血清的1640培養基，適時換液及傳代。細胞處理具體分組為：（1）對照組：在正常條件下培養HTR?8/SVneo 細胞；（2）Aβ1?42組：加入10 μmol/L Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細胞24 h；（3）Aβ1?42＋抗Aβ1?42抗體組：同時加入10 μmol/L Aβ1?42及1：750稀釋抗Aβ1?42抗體處理HTR?8/SVneo細胞24 h。

1.2.3 CCK?8法測定細胞活力取對數生長期的HTR?8/SVneo細胞，接種于96孔板，每孔1× 104個細胞，培養過夜，之后給予不同濃度 Aβ1?42（0、5、10、15、20 μmol/L），同時設立對照組，每組設置5個復孔，并設立空白組。處理24 h后，每孔加入CCK?8試劑10μL，繼續培養2 h。酶標儀測定各個孔在450 nm波長處的吸光度（OD）值。細胞增殖活性（%）=（實驗組細胞OD值?空白組OD值）/（對照組細胞OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞遷移能力選取24孔板的Transwell小室，每組各設3個復孔。上述各組細胞經終止消化后離心棄去培養液，PBS洗滌2遍，用無血清的RPMI 1640培養基重懸細胞，細胞計數并調整細胞密度為5×105/mL，各組分別取200μL加入到上室內，取600μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基加入到下室，37℃，5%CO2培養箱中培養24 h后取出24孔板，用干燥起來的棉簽擦拭上室底部表面未穿過膜的細胞，PBS洗滌2遍后甲醛固定30 min，結晶紫染色5 min，顯微鏡下拍照，隨機取6個不同的視野（×200）觀察并記錄穿膜的細胞數，實驗重復3次，計算每組小室細胞的平均數。

1.2.5 Transwell小室檢測細胞侵襲能力4℃融化Matrigel，于冰上將Matrigel用磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered saline，PBS）按照1∶8稀釋。把Transwell小室放入24孔板中，取50μL稀釋好的Matrigel鋪在小室內，放入細胞培養箱中2～3 h促膠凝固。Transwell上室中分別加入4個組的細胞懸液（密度為1×105個/mL）200μL，下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，37℃、5%CO2培養箱繼續培養24 h，清洗膜，甲醛固定30 min，結晶紫染色5 min，顯微鏡下拍照，隨機取6個不同的視野（×200）觀察并記錄穿膜的細胞數，實驗重復3次，計算每組小室細胞的平均數。

1.2.6 Western blot檢測vimentin，N?cadherin蛋白的表達水平取對數生長期細胞計數后按1∶3比例接種于60 mm細胞培養皿內，培養箱中預培養24 h后，按上述分組法放置培養箱中孵育24 h。取各組HTR?8/SVneo細胞，根據總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，用全自動生化分析儀（Beckman）測定蛋白質濃度。根據蛋白濃度取適量進行SDS?PAGE分離蛋白。將蛋白轉移到硝酸纖維素膜后，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中搖床上封閉2 h，用TBST洗膜10 min，共3次，分別用vimentin、N?cadherin和β?actin的Ⅰ抗按適當比例4℃孵育過夜，再洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG孵育2 h，最后洗膜3×10 min，化學發光。實驗重復3次。

1.2.7 ELISA法檢測MMP?2及 MMP?9表達水平收集細胞培養上清液，按試劑盒說明書進行操作，檢測對照組、10μmol/L Aβ1?42組及10μmol/L Aβ1?42＋1∶750稀釋抗Aβ1?42抗體組細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9水平。實驗重復3次。

1.2.8 MMP?2/MMP?9活性檢測試劑盒檢測MMP?2及MMP?9活性水平收集細胞培養上清液，按試劑盒說明書進行操作，檢測對照組、10μmol/L Aβ1?42組及10 μmol/L Aβ1?42＋1∶750稀釋抗Aβ 1?42抗體組細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9活性水平。實驗重復3次。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料均用Kolmogorov?Smirnov檢驗方法檢驗符合正態性分布，采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。兩獨立樣本t檢驗方法檢驗其方差齊性，采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Aβ1?42體外刺激對滋養細胞活力的影響采用CCK?8法進行細胞活力檢測，如圖1所示，不同濃度Aβ1?42處理后對HTR?8/SVneo細胞活力產生不同影響。與對照組相比，10μmol/L Aβ1?42處理組細胞活力顯著降低（P＜0.05），15μmol/L及20μmol/L處理組細胞活力與10μmol/L Aβ1?42處理組無明顯差異，5μmol/L Aβ1?42處理組對細胞活力無明顯影響。

2.2 Aβ1?42體外刺激對滋養細胞遷移的影響Transwell遷移試驗結果顯示，Aβ1?42組HTR?8/SVneo細胞遷移能力較對照組顯著下降（P＜0.05）；Aβ1?42＋抗Aβ1?42抗體組細胞遷移能力高于Aβ 1?42組，與對照組接近（P＞ 0.05，圖2）。

2.3 Aβ1?42體外刺激對滋養細胞N?cadherin、vi?mentin蛋白表達的影響N?cadherin及vimentin是反映細胞遷移狀態的重要指標。Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細胞后，N?cadherin、vimentin蛋白表達水平較對照組明顯下降；然而，同時加入抗Aβ1?42抗體共同處理細胞后，N?cadherin及vimentin蛋白表達水平顯著上升（圖3）。

圖1 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細胞活力Fig.1 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited HTR?8/SVneo cells viability

圖2 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細胞遷移Fig.2 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited HTR?8/SVneo cells migration ability

圖3 Aβ1?42下調HTR?8/SVneo細胞中N?cadherin、vimentin蛋白的表達Fig.3 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited protein levels of N?cadherin and vimentin in HTR?8/SVneo cells

2.4 Aβ1?42體外刺激對滋養細胞侵襲的影響Transwell侵襲試驗結果顯示，Aβ1?42組HTR?8/SV?neo細胞侵襲能力較對照組顯著下降（P＜0.05）；Aβ1?42＋抗Aβ1?42抗體組細胞侵襲能力高于Aβ 1?42組，與對照組接近（P＞ 0.05，圖4）。

圖4 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細胞侵襲Fig.4 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited HTR?8/SVneo cells invasion ability

2.5 Aβ1?42體外刺激對滋養細胞 MMP?2及MMP?9表達的影響ELISA法檢測細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9表達水平，發現Aβ1?42處理細胞后，細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9的表達水平較對照組明顯下降（P＜0.05）；然而，同時加入抗Aβ1?42抗體共同處理細胞后，細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9表達水平明顯上升，與對照組接近（P＞0.05，圖5）。

2.6 Aβ1?42體外刺激對滋養細胞 MMP?2及MMP?9活性的影響MMP?2/MMP?9活性檢測試劑盒檢測MMP?2及MMP?9活性水平，發現Aβ1?42處理細胞后，細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9活性較對照組明顯下降（P＜0.05）；然而，同時加入抗Aβ1?42抗體共同處理細胞后，細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9活性明顯上升，與對照組接近（P＞ 0.05，圖6）。

圖5 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細胞MMP?2及MMP?9表達Fig.5 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited MMP?2 and MMP?9 expression in HTR?8/SVneo cells

圖6 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細胞MMP?2及MMP?9活性Fig.6 Amyloid β?peptide（1?42）decreased MMP?2 and MMP?9 activity in HTR?8/SVneo cells

3 討論

蛋白質的正確折疊是確保其形成特定構象的關鍵因素，由于蛋白質錯誤折疊發生構象改變，并在機體內異常蓄積而引發的組織病變稱為蛋白質構象病［6］。迄今已發現有20多種蛋白能發生異常聚集，形成淀粉樣沉淀，導致神經退行性疾病等“構象病”的發生［7］。最近研究表明，蛋白錯誤折疊與PE的關系十分密切。BUHIMSCHI、KALKUNTE等研究人員對PE患者的血清、尿液進行蛋白質組學分析，發現PE患者的血清及尿液中均有多種構象錯誤蛋白的沉積，如：Aβ、SERPINA1、albumin、interferon?inducible protein 6?16 等［8-9］。而且，PE 患者的胎盤中APP及相關分泌酶均過量表達，導致大量寡聚化的Aβ生成并聚集沉淀于胎盤絨毛滋養細胞及絨毛間質，其中以42個氨基酸Aβ寡聚體（Aβ1?42）為主要形式［5］。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白（amyloidβ?protein precursor，APP）經β?和γ?分泌酶的蛋白水解作用而產生的含有39～43個氨基酸的多肽，大多與伴侶蛋白分子結合。Aβ具有寡聚化的特性，容易發生構象錯誤，在引起氧化應激和神經退行性病變中發揮直接、重要的作用［10］，但Aβ在PE發病中的具體作用和分子機制目前尚不明確。既往研究表明，PE患者子宮螺旋動脈血管內滋養細胞的數量極少，導致滋養細胞對子宮螺旋動脈的重鑄極其不足，引起管腔狹窄，胎盤發育不完善［2-3］，因此滋養細胞生理遷移、侵襲能力下降可能是PE發病的重要因素［4］。因此本研究利用Aβ1?42 體外刺激HTR?8/SVneo細胞，深入探討Aβ1?42對滋養細胞遷移、侵襲的影響及其調控機制。

本研究發現，Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細胞后，細胞遷移能力較對照組顯著降低，Western blot結果發現N?cadherin、vimentin蛋白表達水平較對照組明顯下降。N?cadherin是鈣黏附素家族的主要成員，參與介導細胞與細胞間的動態黏附。有研究證實，N?cadherin及其調控轉錄因子Twist在絨毛膜外細胞滋養細胞（extravillous cytotropho?blasts，EVT）中高表達，進而促進EVT遷移。通過利用siRNA靶向沉默Twist基因以降低N?cadherin表達時，發現滋養細胞遷移能力明顯下降，提示N?cadherin的高表達與滋養細胞的生理浸潤和遷移關系密切［11-13］。vimentin是維持細胞骨架結構的重要蛋白，有研究證實，上皮來源腫瘤中出現vimentin的高表達與腫瘤侵襲和轉移呈正相關［14］。DU等［15］對PE孕婦胎盤組織進行研究發現，PE孕婦胎盤組織中vimentin的mRNA及蛋白表達水平均較正常孕婦胎盤下降，提示vimentin可能在滋養細胞的生理性浸潤中起著重要作用。本研究通過Transwell侵襲實驗發現Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細胞后，細胞侵襲能力較對照組顯著下降，ELISA法檢測細胞培養上清液中MMP?2及MMP?9表達水平、MMP?2/MMP?9活性檢測試劑盒檢測MMP?2及MMP?9活性，發現Aβ1?42組MMP?2及MMP?9表達水平及活性均較對照組明顯下降。MMP?2、MMP?9是MMPs家族中重要的成員，研究表明，MMP?2、MMP?9與滋養細胞的侵襲力、重鑄螺旋動脈及胎盤形成過程密切相關［16-18］。MMP?2、MMP?9被激活后可以形成Ⅳ型膠原酶降解細胞外基質中Ⅳ型膠原和明膠，為滋養細胞的侵入創造條件［19］。本實驗結果提示Aβ1?42抑制滋養細胞的侵襲能力，可能導致螺旋動脈血管重鑄障礙。

綜上所述，Aβ1?42抑制滋養細胞的遷移、侵襲能力，可能導致螺旋動脈血管重鑄障礙，為β淀粉樣蛋白在PE的病理發生中所起的作用提供理論和實驗依據。然而，Aβ1?42對于滋養細胞遷移、侵襲能力影響的確切分子機制仍有待進一步研究。