腸道微生物與再生障礙性貧血的相關性研究

陳小玉 吳亮亮 周睿卿 許艷麗 李孔揚 張玉玲 王順清

廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院血液內科（廣州 510180）

人類腸道所攜帶的微生物種類繁多，從胃腸道樣本中可檢測出1 000多種腸道微生物，并且數量巨大，估計每個人的腸道微生物超過104個，約為人體細胞總數的10倍［1］。腸道微生物間有著微妙的平衡，打破這種平衡，將導致病理免疫反應和疾病的發生［2］。越來越多的證據表明，腸道微生物與疾病的發生有關。例如，與健康人對比，結直腸癌早期的志賀氏桿菌、枸櫞酸桿菌屬、沙門氏菌的比例更高［3］；克羅恩病患者中的擬桿菌門比例增加，厚壁菌門比例減低［4］；2型糖尿病患者中，厚壁菌門和梭菌綱所占比例明顯降低，并且擬桿菌門/厚壁菌門的比值與血糖濃度呈正相關［5］。近年來，腸道微生物與疾病的關系已成為研究熱點，但再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA），由于發病率較低及取樣困難，國內外尚未報道AA患者的腸道微生物變化情況。AA是一種可能由不同病因和發病機制引起的骨髓造血功能衰竭癥，主要表現為骨髓造血功能低下、全血細胞減少和貧血、出血、感染綜合征，免疫抑制治療有效［6］。AA診斷標準：（1）全血細胞減少，網織紅細胞百分數＜1%，淋巴細胞比例增加；（2）一般無肝、脾大；（3）骨髓多部位增生降低（＜正常50%）或重度降低（＜正常25%），造血細胞減少，非造血細胞比例增加，骨髓小粒空虛，且骨髓活檢可見造血組織均勻減少；（4）除外引起全血細胞減少的其他疾病，如PNH、Fanconi貧血、Evans綜合征等。雖然AA的發病機制至今仍不清楚，但隨著研究的推進，免疫功能異常的理論被越來越多的學者所認同［7］。腸道微生物在維持宿主免疫內環境穩定方面發揮關鍵的作用，是免疫系統的調節器［8］。本研究探討與對照組相比，AA患者是否存在腸道微生物異常改變。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究定義初診AA患者為發病1個月內，未口服/靜脈應用糖皮質激素或其他免疫抑制劑，未接受抗生素治療的AA患者；否則為非初診AA患者。選取2016年12月至2017年12月在廣州市第一人民醫院進行allo?HSCT治療的48例AA患者進行檢測分析，年齡（28.3±13.1）歲，男28例，女20例。其中12例為初診AA患者，年齡（31.9±9.7）歲，男7例，女5例；36例為非初診AA患者，年齡（27.1±13.97）歲，男21例，女15例。移植方式：親緣人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）10/10全相合13例，親緣HLA9/10相合1例，親緣單倍體17例，非親緣HLA10/10全相合10例，非親緣HLA9/10相合7例。同時選取26例供者及10例健康人均無基礎疾病及3個月內未使用任何抗生素，作為對照組，年齡為（29.4±13.5）歲，男22例，女14例。所有研究對象均簽署知情同意書，經本院醫學倫理委員會審批，認定本研究符合醫學倫理標準。

1.2 試劑與儀器QIAamp DNA Stool Mini Kit購于德國Qiagen公司；無水乙醇購于廣東汕頭西隴化工公司；DNA BR購于英國Invitrogen公司；瓊脂糖購于瑞士Lonza公司。-80℃冰箱購于美國Thermo公司；低溫高速離心機購于德國Sigma公司；電熱恒溫水浴鍋購于上海精宏實驗設備有限公司；漩渦混勻器購于德國IKA公司；Qubit Fluorometer購于美國Life儀器；熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；Illumina HiSeq 2500購于美國Illumina公司。

1.3 樣品收集收集48例AA患者以下兩個時間點的糞便樣品并依此分成兩個研究組：（1）移植前組：allo?HSCT前2周，此時尚未預處理，除了小部分（31.3%）患者移植前合并感染需使用抗生素治療外，大部分（68.7%）患者未接受抗生素治療；（2）移植后組：移植后1個月，此時血常規大體恢復正常，AA的免疫紊亂和骨髓衰竭基本被糾正，無感染表現且無需使用抗生素治療。其中有6例AA患者收集了移植后多個時間點的糞便樣品進行檢測，以期探討其腸道微生物動態變化與AA移植后轉歸的相關性。另外擇機收集對照組的糞便樣品。

在樣品收集后，新鮮的樣品一開始儲藏在4℃左右，24 h內分裝在冷凍管里并在-80℃凍存直至使用。

1.4 DNA提取及測序稱取200 mg糞便于2 mL EP管，具體操作步驟按照QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Germany）試劑盒的使用說明書進行。所有離心步驟應該在室溫（15～25℃）、20 000×g（大約14 770 r/min）條件下進行：加入1.4 mL Buffer ASL，渦旋1 min，在95℃下加熱5 min；渦旋15 s并離心1 min，吸取1.2 mL上清液到新的2 mL EP管中，棄去沉淀；加入Inhibit EX Tablet（吸附藥片），渦旋1 min以上至藥片全部懸浮，室溫下孵化1 min；離心3 min，吸取200μL上清液到含有15μL蛋白酶K的1.5 mL EP管中；加入200μL Buffer AL，渦旋15 s，在70℃孵育10 min；加入200μL無水乙醇，渦旋混勻，得到裂解產物；把全部裂解產物涂抹在QIAamp純化柱上，離心1 min；把QIAamp純化柱放入新的2 mL收集管中，加入500μL Buffer AW1，離心3 min；把QIAamp純化柱放入新的2 mL收集管中，加入500μL Buffer AW2，離心3 min；將QIAamp純化柱放入新的1.5 mL EP管中，加入200μL Buffer AE，室溫孵化1 min，然后離心1 min以洗脫DNA。提取后的DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并用Qubit Fluorometer檢測DNA的濃度。

用通用引物515F（5′?GTGCCAGCMGCCGCGG?TAA）、806R（5′?GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴增細菌16SrRNA的V4可變區，其擴增產物在Illu?mina HiSeq 2500平臺測序。測序下機數據經過數據過濾，濾除低質量的reads，剩余高質量的Clean reads方可用于后期分析；通過reads之間的Overlap關系將reads拼接成Tags；在97%的相似度下將Tags聚成 operational taxonomic units（OTU），然后通過OTU與Greengenes 16S參考數據庫比對，對OTU進行物種門、綱、目、科、屬和種水平的注釋，基于OTU進行主成分分析和韋恩圖分析；基于物種注釋結果進行樣品組間物種差異分析。

1.5 統計學方法采用SPSS16.0統計軟件分析，正態分布的數據用均數±標準差表示，2組間數據比較采用t檢驗；非正態分布的數據用中位數表示，2組間數據比較采用Mann?WhitneyU檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 測序結果總共獲得132個糞便樣品，平均每個樣品產生52 567條Tags，Tag平均長度為252 bp，共得到6 938 880條Tags，共產生1 385個OTU。

2.2 AA患者腸道微生物的主成分分析從主成分分析中可以看出對照組、移植前組和移植后組之間表現出分散的分布情況，說明這3組樣品間物種組成有一定的差異（圖1）。

圖1 主成分分析Fig.1 Principal component analysis

2.3 AA患者腸道微生物的韋恩圖分析在97%的相似度下，得到了每個樣品的OTU個數，利用韋恩圖可以展示多組樣品共有和各自特有OTU數目，直觀展示樣品組間OTU的重疊情況。結合OTU所代表的物種，可以找出不同組間的共有微生物（圖2）。

圖2 韋恩圖分析Fig.2 Venn diagram analysis

2.4 AA患者的腸道微生物變化圖3展示了每個樣品分別在門、綱、目、科、屬、種水平的物種profiling柱狀圖，A1～A36為對照組樣品；B1～B48為移植前樣品；C1～C48為移植后樣品。從圖中可以直觀看出不同物種在每個樣品中所占的比例。移植前初診AA患者組與對照組分別在門、綱、目、科、屬和種分類水平中進行共有微生物的比較，發現除了科分類水平的毛螺菌科比較差異有統計學意義外，其他分類水平物種比較差異均無統計學意義；同樣，在移植前非初診AA組也是如此。因此隨后本研究主要分析AA患者移植治療前后毛螺菌科的變化情況。

在移植前，初診AA組毛螺菌科相對豐度中位數為6.91%，比對照組毛螺菌科相對豐度（11.27%）降低（P=0.039）；非初診AA組毛螺菌科相對豐度為7.31%，也比對照組毛螺菌科降低（P=0.010）；但初診組與非初診組之間毛螺菌科相對豐度比較差異無統計學意義（P=0.835）；于是將兩組合并統稱為移植前組，毛螺菌科相對豐度為7.20%，比對照組毛螺菌科降低（P=0.005）（圖4）。

再來對比分析移植前后毛螺菌科的變化情況，移植后組毛螺菌科相對豐度為9.39%，與移植前組毛螺菌科相比，有上升趨勢，但差異無統計學意義（P=0.658）；移植后組毛螺菌科相對豐度與對照組相比，差異也無統計學意義（P=0.061）（圖5）。

圖3 每個樣品分別在門、綱、目、科、屬、種水平的物種profiling柱狀圖Fig.3 The taxonomics composition distribution profiling histograms of each sample were shown at Phylum，Order，Class，Family，Genus，Species level separately

2.5 初步探討再生障礙性貧血患者移植過程中毛螺菌科變化由圖6可見4例allo?HSCT術后血象基本恢復正常的AA患者，毛螺菌科水平整體呈上升趨勢，但在觀察期間內尚未見到上升的平臺期。2例allo?HSCT術后1個月血象基本恢復正常，毛螺菌科水平較移植前升高，但之后血象全面下降，DNA指紋圖檢查提示嵌合率下降，考慮出現繼發性移植物排斥，同時毛螺菌科水平也明顯降低（表1）。

圖4 不同組間毛螺菌科的比較Fig.4 Comparison of Lachnospiraceaeamong different groups

圖5 不同組間毛螺菌科的比較Fig.5 Comparison of Lachnospiraceaeamong in different groups

圖6 移植后6例患者毛螺菌科的變化情況Fig.6 The changes of Lachnospiraceae in 6 patients after transplantation

表1 血象、嵌合率與毛螺菌科的動態變化Tab.1 The dynamic changes of bloodroutine,chimerismratioand Lachnospiraceae

3 討論

腸道微生物現在被認為是人類最重要的微生態系統，其像一個器官，具備代謝、免疫和內分泌等多種生理功能，通過共同進化，宿主不僅可以耐受，而且還形成與微生物互惠互利的關系［9］。腸道微生物的相互作用是復雜的和流動的，能夠適應每天遇到的生理擾動，然而，由于宿主的飲食、藥物和其他環境因素的影響，腸道微生物群大量的或者有選擇性的改變會擾亂微生物內部和宿主-微生物之間的關系，從而引發疾病的病理生理過程［10］。在這項研究中，與對照組的腸道微生物相比，初診AA患者組和移植前組毛螺菌科的相對豐度降低。微生物的分類依據是生物在形態結構和生理功能等方面的相似性，根據微生物的分類，毛螺菌科屬于厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目。CD4+CD25+FOXP3+regulatory Tcell（Treg）細胞在腸道穩定狀態時非常豐富，并且有助于維持腸道和免疫系統穩態。從健康人類糞便樣品中分離出來的梭菌綱（包括毛螺菌科）會影響Treg細胞的數量和功能；在小鼠的動物模型中，口服梭菌綱菌株可以減輕小鼠結腸炎和過敏性腹瀉的癥狀。最近有研究表明，毛螺菌科的相對豐度與Treg/Th17細胞數比值呈正相關，并且與CD4+T細胞內乙酰化組蛋白H3的中位熒光強度水平呈正相關，該研究推測毛螺菌科可能通過調節CD4+T細胞內乙酰化組蛋白H3水平，調控Treg/Th17的免疫平衡［11］。Treg細胞為具有免疫調節功能的T淋巴細胞亞群，其具有免疫抑制功能，參與多種自身免疫性疾病的病理生理過程。最近的研究表明，AA是一種由自身反應性T細胞介導的以攻擊骨髓為主要靶器官的骨髓造血功能衰竭癥，Treg細胞在AA的病理生理過程中發揮著至關重要的作用［12］。Treg細胞幾乎在所有的AA患者中都是減少的，并且FOXP3的蛋白和mRNA水平及NFAT1的蛋白水平也是減少的甚至缺失的，低水平的NFAT1可能導致低FOXP3的表達；Treg細胞的缺失可以增強自身反應性T細胞的產生和AA的發展。AA患者外周血和骨髓中Treg細胞出現的頻率均降低，因為CXCR4（而不是CXCR7）的低表達導致AA患者外周血Treg細胞的遷移能力受損，此外，AA患者Treg細胞抑制由效應T細胞產生的INF?γ的能力下降［12］。AA患者骨髓間充質干細胞由于TGF?β減少促使Treg細胞增殖缺陷，Treg細胞數量減少導致免疫內環境紊亂并進一步加劇骨髓衰竭［13］。有研究發現，AA患者血紅蛋白計數與外周血Treg細胞表達呈正相關，即Treg細胞數量與AA患者貧血程度密切相關［14］。AA患者毛螺菌科的降低可能與Treg細胞的數量和功能相關，并且可能參與AA的病理生理過程。

本研究發現初診AA患者與非初診AA患者（即接受過免疫抑制、抗生素等治療的患者）毛螺菌科相對豐度相比，差異無統計學意義。抗生素、免疫抑制劑等也許對毛螺菌科的影響較少，但本研究的病例數較少，還需更多的初診AA患者進一步驗證此猜測。經過allo?HSCT治療1個月后，AA患者毛螺菌科水平雖然與移植前組相比差異尚無統計學意義（可能與樣本量不足有關），但移植后毛螺菌科水平整體呈上升趨勢，且與對照組毛螺菌科之間的差異無統計學意義。由圖6可見allo?HSCT治療后毛螺菌科水平整體呈上升趨勢，且與移植后血象的動態變化相一致，即移植后血象穩定的患者毛螺菌科逐步上升，移植后血象下降的患者毛螺菌科也隨之降低，但在本研究期間內，尚未見到毛螺菌科上升的平臺期。

綜上所述，毛螺菌科相對豐度的降低可能與AA相關，抗生素、免疫抑制劑等也許對毛螺菌科的影響較少，allo?HSCT術后AA的免疫紊亂和骨髓衰竭基本被糾正時，毛螺菌科水平整體呈上升趨勢。毛螺菌科與AA之間的關系也許會導致對AA發病機制的新認識，今后可以擴大研究的病例數，進一步探討造血干細胞移植過程中毛螺菌科的動態變化過程并尋找毛螺菌科恢復正常的時間點，同時評估AA患者毛螺菌科變化是否與Treg細胞，尤其是Treg/Th17的免疫平衡相關。